【摘要】：細(xì)胞分裂(cell division)是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一,主要包括細(xì)胞核分裂和胞質(zhì)分裂(cytokinesis)兩步。胞質(zhì)分裂作為細(xì)胞分裂的最后一步,將一個(gè)母細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,異常的胞質(zhì)分裂可能會(huì)導(dǎo)致一系列疾病,甚至機(jī)體死亡。在酵母細(xì)胞中,異常的胞質(zhì)分裂會(huì)導(dǎo)致形成無(wú)核或者多核的細(xì)胞。在絲狀真菌中,胞質(zhì)分裂對(duì)于產(chǎn)孢、產(chǎn)隔和菌絲生長(zhǎng)都有十分重要的作用。胞質(zhì)分裂主要是由肌動(dòng)蛋白收縮環(huán)(contractile actin ring,CAR)收縮拉著細(xì)胞膜內(nèi)陷使細(xì)胞縊裂成兩個(gè)子細(xì)胞,在真菌細(xì)胞中還伴隨著隔膜的形成。這一過(guò)程大致可以分為四步:選擇分裂位點(diǎn)、肌動(dòng)蛋白收縮環(huán)的組裝、肌動(dòng)蛋白收縮環(huán)收縮以及收縮完成后的去組裝。前期研究發(fā)現(xiàn),在模式絲狀真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中存在一條由一系列保守激酶組成的隔膜形成開(kāi)始網(wǎng)絡(luò)(Septation Initiation Network,SIN)正向調(diào)控胞質(zhì)分裂過(guò)程。其中Sep H是SIN信號(hào)途徑中的核心組分,對(duì)胞質(zhì)分裂和無(wú)性產(chǎn)孢起著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)Sep H缺失時(shí)菌絲胞質(zhì)分裂缺陷、不產(chǎn)隔膜和無(wú)性孢子,當(dāng)過(guò)表達(dá)Sep H時(shí)菌絲過(guò)度產(chǎn)隔。但是目前關(guān)于胞質(zhì)分裂調(diào)控的研究仍然不夠清楚,人們對(duì)于胞質(zhì)分裂的調(diào)控機(jī)制知之甚少。sep H1是一株溫度敏感型突變株,在限制性溫度42℃培養(yǎng)時(shí)Sep H失活。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)紫外誘變得到116株產(chǎn)隔和產(chǎn)孢恢復(fù)的突變菌株,表明存在其它調(diào)控因子參與胞質(zhì)分裂的調(diào)控。因此,本研究以絲狀模式真菌構(gòu)巢曲霉為研究材料,基于以上突變體庫(kù)篩選新的胞質(zhì)分裂調(diào)控因子并對(duì)其調(diào)控機(jī)制展開(kāi)研究,主要得到以下結(jié)論:1、蛋白激酶Pom A是sepH1的反向調(diào)節(jié)子。首先,用正向遺傳學(xué)的方法尋找sepH1的反向調(diào)節(jié)子。通過(guò)菌落表型分析和顯微鏡觀察篩選出產(chǎn)隔與產(chǎn)孢恢復(fù)的菌株,通過(guò)曲霉雜交驗(yàn)證突變菌株為非sep H回復(fù)突變。用二代測(cè)序技術(shù)和SNP分析發(fā)現(xiàn)突變株中蛋白激酶Pom A的活性位點(diǎn)發(fā)生突變。接下來(lái),用反向遺傳學(xué)的方法進(jìn)行驗(yàn)證,構(gòu)建sep H1和pom A雙突變菌株,菌落表型分析以及顯微鏡觀察顯示sep H1和pom A雙突變菌株相較于sep H1單突變菌株產(chǎn)隔與產(chǎn)孢都有恢復(fù),表明Pom A是sep H1的反向調(diào)節(jié)子。2、Pom A通過(guò)負(fù)調(diào)控MAPK途徑的活性反向調(diào)節(jié)Sep H。定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)顯示敲除Pom A后MAPK途徑活性升高。Western blot顯示,與野生型對(duì)比sep H1中MAPK活性明顯降低,而Pom A突變菌株中MAPK活性升高,表明Sep H是MAPK途徑的正調(diào)節(jié)子,而Pom A是負(fù)調(diào)節(jié)子。通過(guò)顯微鏡觀察,鹽逆境激活MAPK途徑也能恢復(fù)sep H1隔膜與孢子的產(chǎn)生。表明Pom A通過(guò)和Sep H協(xié)同調(diào)控MAPK途徑活性進(jìn)而反向調(diào)節(jié)Sep H。3、Paxillin蛋白Pax B參與調(diào)控產(chǎn)隔與產(chǎn)孢。通過(guò)生物信息學(xué)分析,構(gòu)巢曲霉中包含兩個(gè)paxillin蛋白Pax A和Pax B。敲除Pax B后,菌落不產(chǎn)孢子,菌絲細(xì)胞不產(chǎn)隔膜,表明Pax B參與產(chǎn)隔與產(chǎn)孢的調(diào)控。4、AcnA和Pax B通過(guò)調(diào)控Actin環(huán)在分裂位點(diǎn)的組裝而參與調(diào)控胞質(zhì)分裂。通過(guò)GFP熒光標(biāo)記和熒光顯微鏡觀察,在Acn A和Pax B敲除菌株中,Actin不能在分裂位點(diǎn)組裝成環(huán)狀結(jié)構(gòu)而造成胞質(zhì)分裂缺陷。表明Acn A和Pax B是Actin環(huán)組裝所必須的。綜上所述,本文發(fā)現(xiàn)一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)子Pom A和兩個(gè)正向調(diào)節(jié)子AcnA和Pax B參與調(diào)控構(gòu)巢曲霉的胞質(zhì)分裂,并闡明了它們的調(diào)控機(jī)制,豐富和完善了胞質(zhì)分裂調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)細(xì)胞的胞質(zhì)分裂活動(dòng)有了新的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q253
【圖文】：

胞質(zhì)分裂都是相對(duì)保守的 (圖1.1)，大致可以分為四個(gè)關(guān)鍵步驟：一、選擇胞質(zhì)分裂位點(diǎn)，在接收到開(kāi)始胞質(zhì)分裂的信號(hào)后細(xì)胞中的地標(biāo)蛋白 (landmarks protein) 會(huì)首先到胞質(zhì)分裂位點(diǎn)定位并引導(dǎo)和招募其他參與胞質(zhì)分裂的蛋白聚集并展開(kāi)后續(xù)的胞質(zhì)分裂活動(dòng)；二、胞質(zhì)分裂復(fù)合體的組裝，當(dāng)選擇好胞質(zhì)分裂位點(diǎn)后，胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白陸續(xù)定位到分裂位點(diǎn)共同參與 Actin 收縮環(huán)的組裝。三、Actin 環(huán)的收縮，當(dāng) Actin 環(huán)組裝完成后，細(xì)胞中的調(diào)控信號(hào)將會(huì)啟動(dòng) Actin 環(huán)的收縮。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中收縮的Actin 環(huán)會(huì)牽拉著細(xì)胞膜的內(nèi)陷最終將細(xì)胞縊裂成兩個(gè)子細(xì)胞，從而完成胞質(zhì)分裂。而在真菌細(xì)胞中，Actin 環(huán)為細(xì)胞膜的內(nèi)陷提供拉力，同時(shí)在分裂位點(diǎn)會(huì)形成幾丁質(zhì)隔膜提供推力，在兩種力的共同作用下完成胞質(zhì)分裂。四、去組裝，為了順利進(jìn)行接下來(lái)的生命活動(dòng)，胞質(zhì)分裂完成后組裝在分裂位點(diǎn)的蛋白復(fù)合體中一部分蛋白轉(zhuǎn)移到其他地方繼續(xù)發(fā)揮功能，而另一些蛋白則會(huì)被降解回收利用[14]。圖 1.1 不同物種中的胞質(zhì)分裂[15]Fig.1.1 Cytokinesis in different model or

圖 1.2 芽殖酵母中的 Septin 蛋白 (綠色)[35]Fig.1.2 Septins (green) in the cell cycle of S. cerevisiae Actin 環(huán)Actin 是肌動(dòng)蛋白收縮環(huán)中最關(guān)鍵的組分，收縮的 Actin 環(huán)作為一個(gè)動(dòng)力拉著細(xì)胞膜內(nèi)陷最終完成胞質(zhì)分裂 (圖 1.3)。Actin 環(huán)的組裝非常復(fù)雜，需多蛋白的相互作用才能形成一個(gè)完整有功能的 Actin 環(huán)。其中研究較多的是 Actin 環(huán)時(shí)需要的一類(lèi)保守蛋白 formin。在裂殖酵母中 formin 蛋白為 Cdc在芽殖酵母中為 Bni1[39]，在構(gòu)巢曲霉中它們的同源蛋白為 SepA[40-4rmin 蛋白的缺失都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不能正常形成 Actin 環(huán)狀結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致胞質(zhì)分裂。除此之外，Actin 環(huán)的形成還需要很多蛋白的協(xié)助，比如說(shuō)研究較多的 Pax白以及 Septin 蛋白[43]，在酵母中以及其他形成細(xì)胞壁的真菌細(xì)胞分裂過(guò)程

圖 1.3 后生動(dòng)物以及芽殖酵母細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成[49]Fig.1.3 Actomyosin ring formation in budding yeast and metazoan cells1.4 真菌的胞質(zhì)分裂1.4.1 真菌的概述不管是從微小生物的利用或者防治還是到哺乳動(dòng)物組織器官發(fā)育或者疾病治療等方面，胞質(zhì)分裂作為十分重要的生命活動(dòng)都具有較大的研究意義。但是由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞操作難度大和操作成本高等原因，讓繁殖速度快、結(jié)構(gòu)相較簡(jiǎn)單和具有遺傳可操作性等優(yōu)點(diǎn)的真菌成為研究胞質(zhì)分裂很好的模式生物。常見(jiàn)的真菌主要可以分為三類(lèi)：蕈菌、酵母菌以及霉菌 (絲狀真菌)。而目前研究胞質(zhì)分裂常用的模式真菌主要有三種，分別為芽殖酵母、裂殖酵母以及絲狀真菌構(gòu)巢曲霉。接下來(lái)將對(duì)這三種真菌的胞質(zhì)分裂機(jī)制一一進(jìn)行闡述。

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本文編號(hào)：2764392