【摘要】：脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)和鳥苷三磷酸(GTP)是體內(nèi)合成DNA或RNA的前體,同時也作為基于PCR技術(shù)發(fā)展而來的各種現(xiàn)代生物技術(shù)的重要原料。研究中我們使用滲透化共表達(dá)鳥苷酸激酶和乙酸激酶的全細(xì)胞生物合成dGTP和GTP,同時也探索了細(xì)菌細(xì)胞表面展示構(gòu)建的全細(xì)胞催化劑于生物合成反應(yīng)中的運(yùn)用。我們將保加利亞乳桿菌的鳥苷酸激酶和大腸桿菌的乙酸激酶編碼基因gmk和ack克隆進(jìn)質(zhì)粒pET28-a中,構(gòu)建兩株單基因表達(dá)菌。然后利用載體上的同尾酶酶切位點(diǎn)構(gòu)建雙基因共表達(dá)菌,根據(jù)串聯(lián)順序命名為pAG和pGA。經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后,在25 ℃下使用10 mM EDTA處理菌體30 min,酶活力相對于粗酶液損失較小,在37 ℃催化5 mM底物dGMP,反應(yīng)2.5 h后,底物轉(zhuǎn)化率為91%;催化5 mM GMP,反應(yīng)1.5 h后,轉(zhuǎn)化率為95%。通過與冰核蛋白的N末端或N、C末端融合體相連,我們成功在大腸桿菌細(xì)胞表面展示了鳥苷酸激酶和乙酸激酶。使用0.2 mM IPTG在25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)30h可以獲得大量可溶性目標(biāo)蛋白。使用表面展示酶37 ℃下催化5 mM底物dGMP,反應(yīng)4 h后,轉(zhuǎn)化率達(dá)到91%;催化5 mM底物GMP,反應(yīng)3 h,轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%。并且其在37 ℃下穩(wěn)定性很好,經(jīng)過9次重復(fù)回收后,仍保持50%以上的酶活性。合成反應(yīng)通過偶聯(lián)一個乙酸激酶催化的ATP循環(huán)再生用于提供核苷酸磷酸化過程所需的磷酸基團(tuán),大大降低了生產(chǎn)成本。研究發(fā)現(xiàn),只需添加起始底物濃度二十分之一的ATP便可滿足反應(yīng)所需。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q55;Q78
【圖文】：

制反應(yīng)體系中磷酸供體（ＮＴＰ）的添加量為０．２５ｍＭ，底物濃度為５ｍＭ，邋ＡＣＫａｓｅ的添逡逑加量為２昭。對于ＧＴＰ合成反應(yīng)，加入３．７８肫ＧＭＫａｓｅ。對于ｄＧＴＰ合成反應(yīng)，加入逡逑３７．８邋ｐｇ邋ＧＭＫａｓｅ。如圖２．４所示，無論是在ＧＴＰ合成反應(yīng)還是ｄＧＴＰ合成反應(yīng)中，ＡＴＰ逡逑作為磷酸供體時，底物轉(zhuǎn)化率最高。反應(yīng)６ｈ后，底物ＧＭＰ轉(zhuǎn)化率達(dá)到９５％，底物ｄＧＭＰ逡逑轉(zhuǎn)化率達(dá)到９１％。而ＵＴＰ，ＣＴＰ和ＧＴＰ作為磷酸供體T，效果很差。逡逑

循環(huán)來降低生產(chǎn)成本。逡逑由于在反應(yīng)中，ＡＴＰ僅作為轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸基團(tuán)的中介，過多的ＡＴＰ并＋能提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)逡逑化字．。因此迎過改變磷酸供休ＡＴＰ的起始濃度來探究Ｍ適的ＡＴＰ濃度，結(jié)果如圖２．５所逡逑ＴＪｎ邋0逡逑對于ＧＴＰ合成反應(yīng)，反應(yīng)起始時加入０．２５邋ｍＭ的ＡＴＰ（底物ＧＭＰ起始濃度的丨／２０），逡逑反應(yīng)６邋ｌｉ后，ＧＭＰ的轉(zhuǎn)化韋達(dá)到９５°／。，與起始加入０．５邋ｍＭ邋ＡＴＰ的底物轉(zhuǎn)化率丨ＮＭ。這逡逑意味著反應(yīng)起始時加入０．２５邋ｍＭ的ＡＴＰ即ｗ丨滿足反應(yīng)需求。繼續(xù)減少ＡＴＰ濃度會降低逡逑

本章所涉及的試劑、儀器以及實(shí)驗方法，若無注明，則與第２章相同。逡逑３．１．１共表達(dá)重組菌株的構(gòu)建逡逑將在第２章屮構(gòu)建好的ＧＭＫａｓｅ和ＡＣＫａｓｅ重組菌過夜培養(yǎng)后，抽提質(zhì)粒。如圖３．１逡逑所示，將重組質(zhì)粒依照構(gòu)建方案在３７邋°Ｃ邋Ｆ雙酶切反應(yīng)３邋ｈ，為了探究以說和基因在逡逑質(zhì)粒上串聯(lián)的前后順序?qū)χ亟M菌共表達(dá)的影響，我們構(gòu)建了共表達(dá)重組菌ｐＧＡ和ｐＡＧ，逡逑分別以ｇＭ在上游，ｏｄ在下游和以0＜：々在＿丨：游，ｇｗ丨在卜游。逡逑構(gòu)建好的重組質(zhì)粒ｐＧＡ和ｐＡＧ分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ＤＨ５ｃｔ中，過夜培逡逑養(yǎng)后，挑取平板ｈ的單

本文編號：2760121