【摘要】：組蛋白的翻譯后修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控方式,多發(fā)生于組蛋白的N端柔性區(qū),包括甲基化、乙�；�、磷酸化等修飾。組蛋白的翻譯后修飾及其多種組合方式,構(gòu)成了特定的組蛋白密碼,包含著特定的生物學(xué)信息。組蛋白密碼經(jīng)由特殊的效應(yīng)分子(reader)解碼,觸發(fā)下游一系列生物學(xué)事件的發(fā)生,進(jìn)而參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。同時(shí),組蛋白的修飾水平受到特定修飾酶(writer)與去修飾酶(eraser)的動(dòng)態(tài)調(diào)控。組蛋白的乙�；揎検茄芯康幂^為深入的一種酰基化修飾。除此之外,隨著近年來(lái)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,包括丙酰化、丁酰化、琥珀�；�、丙二酰化、丁二酰化、羥異丁基化、β-羥基丁�；投辊；仍趦�(nèi)的一些新型的酰基化修飾,逐漸被鑒定出來(lái)。組蛋白的酰基化修飾受到�；D(zhuǎn)移酶和去酰基化酶的共同調(diào)節(jié)。其中,sirtuin家族蛋白(Sirtl-7)作為一類重要的去酰基化酶,參與調(diào)控組蛋白�；揎椀娜コＦ浼易宄蓡TSirt5主要定位于線粒體,也被報(bào)道在核內(nèi)有定位。與其他sirtuin蛋白相比,Sirt5的去乙酰化活性較弱,但能夠特異性地識(shí)別并催化賴氨酸上帶負(fù)電荷的修飾基團(tuán)的移除,發(fā)揮去琥珀�；⑷ケ；腿ノ於溁揎椀墓δ堋Ｔ诒菊撐牡牡谝徊糠�,我們針對(duì)人源去酰基化酶Sirt5對(duì)不同的組蛋白玻珀�；揎椢稽c(diǎn)的選擇偏好性展開(kāi)了一系列生化與結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。通過(guò)光交聯(lián)pull down及l(fā)abel-free質(zhì)譜方法,我們鑒定了與組蛋白H3K122琥珀�；‰�(H3K122su)結(jié)合的蛋白Sirt5。進(jìn)一步的酶活實(shí)驗(yàn)表明,Sirt5可以移除H3K122琥珀�；‰牡男揎椈鶊F(tuán)。此外,Sirt5還被報(bào)道可以在體外催化H3K9su的去琥珀�；磻�(yīng),暗示其組蛋白去玻珀酰化酶的活性。為探究Sirt5移除不同位點(diǎn)的組蛋白琥珀酰化修飾的分子機(jī)制,我們合成了包含已被鑒定的14種琥珀�；揎椢稽c(diǎn)的組蛋白小肽,并檢測(cè)了 Sirt5對(duì)小肽的去琥珀酰化酶活性。結(jié)果顯示,Sirt5可移除多個(gè)組蛋白位點(diǎn)的琥珀�；揎�,但對(duì)H4K31su位點(diǎn)沒(méi)有活性。為進(jìn)一步探究Sirt5對(duì)底物的識(shí)別機(jī)制,我們解析了 Sirt5分別與H3K122su、H2AK95su、H2BK120su以及H4K91su小肽的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),并通過(guò)序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)分析和突變體的酶活實(shí)驗(yàn)證明,Sirt5不能移除+1位為脯氨酸的組蛋白琥珀酰化位點(diǎn),闡明了 Sir5作為一種廣泛但具有序列選擇性的組蛋白去琥珀�；赴l(fā)揮功能的分子機(jī)制。此外,免疫熒光實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)酶活實(shí)驗(yàn)表明,Sirt5蛋白可定位于HeLa細(xì)胞核,且具有內(nèi)源性去組蛋白琥珀�；揎椀哪芰Α＿@一結(jié)果進(jìn)一步暗示了 Sirt5作為一種組蛋白去琥珀�；�,通過(guò)調(diào)控組蛋白琥珀�；桨l(fā)揮重要的生物學(xué)功能。本論文的第二部分為金黃色葡萄球菌表面蛋白SdrE的結(jié)構(gòu)與功能研究。SdrE可通過(guò)結(jié)合宿主的補(bǔ)體因子H(FH),發(fā)揮免疫逃逸功能。我們通過(guò)GST pull down及ITC實(shí)驗(yàn)確定了 FH與SdrE的最短結(jié)合區(qū)域,并測(cè)定了二者的親和力。我們解析了 SdrE的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域N2N3(SdrE-N2N3)及其與FH多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),確定了 FH在該結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn),并通過(guò)定點(diǎn)突變進(jìn)一步獲得了參與結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。基于晶體結(jié)構(gòu)分析,我們證實(shí)了 SdrE在配體結(jié)合時(shí)存在著變構(gòu)效應(yīng),且提出了一個(gè)新奇的“CDLL”配體結(jié)合模型,為金黃色葡萄球菌依賴SdrE實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的分子機(jī)制做出了解釋。本論文的第三部分為金黃色葡萄球菌核酸內(nèi)切酶RNase HII的結(jié)構(gòu)與功能研究。RNaseHII能夠切割DNA-RNA雜交鏈,參與RNA錯(cuò)配、岡崎片段的移除、核酸代謝、DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過(guò)程。我們解析了金黃色葡萄球菌RNase HII的二聚體晶體結(jié)構(gòu),通過(guò)多角度靜態(tài)光散射和小角散射實(shí)驗(yàn)測(cè)定其在溶液中的聚集狀態(tài),并通過(guò)電子自旋共振進(jìn)一步佐證其二聚形式。生化實(shí)驗(yàn)顯示,二體形式的RNase HII仍然具有底物催化活性,暗示其聚集狀態(tài)具有特殊的生理學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q75
【圖文】：

章Ｓｉｒｔ５催化組蛋白去琥珀�；揎椀姆肿訖C(jī)制同修飾底物的偏好性。Ｓｉｒｔ５能夠選擇地水解小肽／琥珀�；且阴；揎椈鶊F(tuán)，其催化機(jī)制與其類似，都是利用ＮＡＤ＋作為輔助因子，生成ＮＡ去修飾后的底物［２３４］。逡逑ｉｒｔ５與Ｈ３Ｋ９琥珀�；揎椥‰募埃危粒模膹�(fù)合物基與Ｓｉｒｔ５底物口袋中的Ｔｙｒｌ０２和Ａｒｇｌ０５發(fā)生在ＩＩＩ類ｓｉｒｔｕｉｎ蛋白中保守的氨基酸的突變將導(dǎo)降低，表明二者對(duì)底物結(jié)合的重要性［２３４］。逡逑

｜邐Ｅｌｕｔｉｏｎ邐｜逡逑＋邋＊邋＋邋？逡逑ｕ—邐）逡逑Ｉ逡逑ｉ逡逑ｆ邐ｉ逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邐Ｉ邐Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ逡逑邐邐Ｊ邐ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑■■■■—？邐｜邐＿逡逑—邋ＨＩ邐！邐�。赀姡义希瑁蜻姡贿姡椋爝�？邐ｉ邐ｉ逡逑ｉ邐＾邋ｍ逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邐Ｊ邐！｜邐？邋｜邐｜邐｜逡逑Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｉ邐－１—■Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋�。�！—逡逑＾邐＾邋ｊ邋ｍ／Ｚ逡逑ＩＵ＿ｉ逡逑ｍ／ｚ逡逑ｒｅｅ質(zhì)譜技術(shù)鑒定全細(xì)胞中Ｈ３Ｋ１２２ｓｕ結(jié)合蛋白的Ｍａｒｋｅｒ邐Ｐｒｏｂｅ邋Ｃ邋Ｐｒｏｂｅ邋１逡逑

ｍ／ｉ逡逑ＡＬＤＩ－ＴｏＦ質(zhì)譜檢測(cè)Ｓｉｒｔ５對(duì)Ｈ３Ｋ１２２ｓｕ小肽的組未加Ｓｉｒｔ５。小肽的質(zhì)譜譜峰質(zhì)荷比ｍ／ｚ以對(duì)組蛋白琥珀酰化賴氨酸具有廣泛的ｉｒｔ５是否對(duì)組蛋白琥珀�；揎椢稽c(diǎn)的移除具１４種包括Ｈ３Ｋ９和所有己知的人源組蛋白琥珀�；揎椥‰模ū恚保常玻Ｍㄟ^(guò)Ｓｉｒｔ５酶活實(shí)驗(yàn)，Ｓｉｒｔ５對(duì)不同琥珀酰化修飾的組蛋白小肽的催化明，在１４種合成的小肽中，僅有Ｈ４Ｋ３１ｓｕ小化去除。逡逑

本文編號(hào)：2758073