發(fā)布時間：2020-07-15 22:39

【摘要】：人血清白蛋白是臨床上具有重要應用的蛋白,但重組人血清白蛋白未能工業(yè)化生產,嚴重限制了它在臨床上的供應。本課題開展人血清白蛋白高效表達和相關的畢赤酵母中基因編輯技術的研究具有重要的應用前景。本文首先將密碼子優(yōu)化后的人血清白蛋白基因通過同源重組技術,整合到畢赤酵母基因組的HIS4位點,構建了能表達重組人血清白蛋白的畢赤酵母菌株,初步優(yōu)化了表達條件后搖瓶發(fā)酵產量在0.52 g/L。為能夠利用代謝工程技術促進重組人血清白蛋白的工業(yè)化生產,進一步開展了建立高效的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的研究,以便后續(xù)能有效地對畢赤酵母進行系統(tǒng)改造。本文從質粒構建出發(fā),在比較了五種畢赤酵母ARSs(PARS1,panARS,mitoARS,PpARS2和ScARS)的質粒轉化效率、穩(wěn)定性和拷貝數后,構建了 RNA pol Ⅲ啟動子控制下的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。這一新系統(tǒng)與以PARS 1為復制子的系統(tǒng)相比,編輯效率提高10倍,高達80%。本文繼續(xù)將Cas9基因整合到基因組上,發(fā)現無論是RNA pol II啟動子還是RNA pol Ⅲ啟動子,只要使用畢赤酵母本身的啟動子來表達sgRNA均能有較高的編輯效率。最終在畢赤酵母中,構建了基因敲除效率在80%以上而且基因整合效率在70%以上的CRISPR/Cas9基因組編輯新技術�？傊�,本論文構建成功了一個重組表達生產人血清白蛋白的畢赤酵母基因工程菌,并且進一步建立了更高效的CRISPR/Cas9基因組編輯新技術。這一更高效的基因組編輯技術的建立,將大大加快畢赤酵母基因組改造的效率,從而有利于提高包括人血清白蛋白在內的多種重要醫(yī)用蛋白質的高效和高質量生產。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

人血清白蛋白（ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）是人類血裝中含量最豐富的蛋逡逑白質，在血漿中濃度為３５－５０邋ｇ／ｌ［１２］，約占血漿總蛋白的６０％［１３］。ＨＳＡ是由５８５逡逑個氨基酸組成的單鏈球狀不對稱心形蛋白（圖１－１），其分子量為６６．５ｋＤ，分子中逡逑含有３５個半骯氨酸，形成了邋１７個二硫鍵。早在１９７５年，Ｍｅｌｏｕｎ等人就已經確逡逑定了邋ＨＳＡ完整的氨基酸序列［１４］，而當時由于技術限制，ＨＳＡ的二級結構及三逡逑級結構并未確定。逡逑圖１－１邋ＨＳＡ蛋白結構逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＳＡ逡逑直至１９８９年，為了解ＨＳＡ的結構，Ｃａｒｔｅｒ等人首次在６．０邋Ａ分辨率下對人逡逑血清白蛋白的三維結構進行了解析，并于１９９２年提供了更高分辨率（２．８Ａ）條逡逑件下的結構解析結果［１５１。隨后，隨著蛋白分質結構分析技術的發(fā)展，在１９９９年，逡逑Ｓｕｇｉｏ團隊在２．５邋Ａ的分辨率下對人血清白蛋白的分子結構進行了進一步分析［１３；逡逑｜６］。通過以上研究發(fā)現，ＨＳＡ是一種ａ－螺旋程度較高的蛋白，其二級結構中含有逡逑２逡逑

逡逑６７％的ａ－螺旋，此外還有２３％的延伸鏈和１０％的ｐ－轉角結構，其結構如圖１－１所逡逑示。完整的ＨＳＡ由三個結構相似的結構域構成，這三個結構域都是通過ａ－螺旋逡逑形成，分別為１－１９５氨基酸組成的結構域Ｉ，１９６－３８３氨基酸組成的結構域ＩＩ，以逡逑及３８４－５８５氨基酸組成的結構域ＩＩＩ。每個結構域包含１０個反向平行螺旋結構，逡逑可以分為ａ和ｂ兩個子域，其中子域ａ含有６個螺旋，子域ｂ包含４個螺旋［１＾逡逑１９ｌＨＳＡ的球狀心形結構使其具有較好的彈性，但是當與其他分子結合時，其形逡逑狀會根據結合的分子不同而產生不同的變化，例如白蛋白與藥物結合后的結構改逡逑變能夠影響藥物在體內的分布和清除，因此ＨＳＡ在臨床治療方面具有重要作用。逡逑ＨＳＡ中一共有３５個Ｃｙｓ

因此這兩種酶都能促進ｈｒ的效率。逡逑除ＨＲ外，機體內還存在另外一種重要的ＤＮＡ損傷修復方式，那便是非同逡逑源末端連接（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｅｎｄ邋ｊｏｉｎｉｎｇ，邋ＮＨＥＪ），修復過程如圖１－３所示。參逡逑ＮＨＥＪ過程的一種重要的蛋白是Ｋｕ蛋白，該蛋白是Ｋｕ７０和Ｋｕ８０的異二聚體，逡逑用于識別ＤＳＢ。當Ｋｕ蛋白識別到ＤＳＢ后，便會結合到斷裂末端，召集ＤＮＡ－逡逑ＰＫｃｓ邋（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｓｕｂｕｎｉｔ）通過自淲酸化激活邋ＮＨＥＪ逡逑修復，而后利用Ａｒｔｅｍｉｓ重組酶加工ＤＮＡ末端，最后通過ＤＮＡ連接酶將處理完逡逑的末端進行連接，達到修復ＤＮＡ鏈斷裂的目的Ｗ１。與同源重組不同，非同源末逡逑端連接不需要同源模板的參與，利用該過程對ＤＳＢ進行修復更為簡便，但是也逡逑更容易導致基因的插入、缺失和點突變等錯誤修復。逡逑？＇－邐５，Ｈ邋Ｔｉｒｇｃｔ邋ｓｅｎｅ邋３，邋Ｈ邋邐逡逑邐ＨＲ邐邋邐ＮＨＥＪ邐逡逑Ｒａｎｄｏｍ邋ｇｅｎｅ邋ｌｏｃｕｓ逡逑邐邋５＞Ｈ邋Ｔａｒｊ�。澹簦遥澹睿邋澹常冗姟义希颍插澹澹澹�

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