【摘要】：人血清白蛋白是臨床上具有重要應(yīng)用的蛋白,但重組人血清白蛋白未能工業(yè)化生產(chǎn),嚴重限制了它在臨床上的供應(yīng)。本課題開展人血清白蛋白高效表達和相關(guān)的畢赤酵母中基因編輯技術(shù)的研究具有重要的應(yīng)用前景。本文首先將密碼子優(yōu)化后的人血清白蛋白基因通過同源重組技術(shù),整合到畢赤酵母基因組的HIS4位點,構(gòu)建了能表達重組人血清白蛋白的畢赤酵母菌株,初步優(yōu)化了表達條件后搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量在0.52 g/L。為能夠利用代謝工程技術(shù)促進重組人血清白蛋白的工業(yè)化生產(chǎn),進一步開展了建立高效的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的研究,以便后續(xù)能有效地對畢赤酵母進行系統(tǒng)改造。本文從質(zhì)粒構(gòu)建出發(fā),在比較了五種畢赤酵母ARSs(PARS1,panARS,mitoARS,PpARS2和ScARS)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率、穩(wěn)定性和拷貝數(shù)后,構(gòu)建了 RNA pol Ⅲ啟動子控制下的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。這一新系統(tǒng)與以PARS 1為復(fù)制子的系統(tǒng)相比,編輯效率提高10倍,高達80%。本文繼續(xù)將Cas9基因整合到基因組上,發(fā)現(xiàn)無論是RNA pol II啟動子還是RNA pol Ⅲ啟動子,只要使用畢赤酵母本身的啟動子來表達sgRNA均能有較高的編輯效率。最終在畢赤酵母中,構(gòu)建了基因敲除效率在80%以上而且基因整合效率在70%以上的CRISPR/Cas9基因組編輯新技術(shù)�？傊�,本論文構(gòu)建成功了一個重組表達生產(chǎn)人血清白蛋白的畢赤酵母基因工程菌,并且進一步建立了更高效的CRISPR/Cas9基因組編輯新技術(shù)。這一更高效的基因組編輯技術(shù)的建立,將大大加快畢赤酵母基因組改造的效率,從而有利于提高包括人血清白蛋白在內(nèi)的多種重要醫(yī)用蛋白質(zhì)的高效和高質(zhì)量生產(chǎn)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

人血清白蛋白（ＨｕｍａｎＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）是人類血裝中含量最豐富的蛋逡逑白質(zhì)，在血漿中濃度為３５－５０邋ｇ／ｌ［１２］，約占血漿總蛋白的６０％［１３］。ＨＳＡ是由５８５逡逑個氨基酸組成的單鏈球狀不對稱心形蛋白（圖１－１），其分子量為６６．５ｋＤ，分子中逡逑含有３５個半骯氨酸，形成了邋１７個二硫鍵。早在１９７５年，Ｍｅｌｏｕｎ等人就已經(jīng)確逡逑定了邋ＨＳＡ完整的氨基酸序列［１４］，而當(dāng)時由于技術(shù)限制，ＨＳＡ的二級結(jié)構(gòu)及三逡逑級結(jié)構(gòu)并未確定。逡逑圖１－１邋ＨＳＡ蛋白結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＳＡ逡逑直至１９８９年，為了解ＨＳＡ的結(jié)構(gòu)，Ｃａｒｔｅｒ等人首次在６．０邋Ａ分辨率下對人逡逑血清白蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行了解析，并于１９９２年提供了更高分辨率（２．８Ａ）條逡逑件下的結(jié)構(gòu)解析結(jié)果［１５１。隨后，隨著蛋白分質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)的發(fā)展，在１９９９年，逡逑Ｓｕｇｉｏ團隊在２．５邋Ａ的分辨率下對人血清白蛋白的分子結(jié)構(gòu)進行了進一步分析［１３；逡逑｜６］。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，ＨＳＡ是一種ａ－螺旋程度較高的蛋白，其二級結(jié)構(gòu)中含有逡逑２逡逑

逡逑６７％的ａ－螺旋，此外還有２３％的延伸鏈和１０％的ｐ－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如圖１－１所逡逑示。完整的ＨＳＡ由三個結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，這三個結(jié)構(gòu)域都是通過ａ－螺旋逡逑形成，分別為１－１９５氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域Ｉ，１９６－３８３氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域ＩＩ，以逡逑及３８４－５８５氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域ＩＩＩ。每個結(jié)構(gòu)域包含１０個反向平行螺旋結(jié)構(gòu)，逡逑可以分為ａ和ｂ兩個子域，其中子域ａ含有６個螺旋，子域ｂ包含４個螺旋［１＾逡逑１９ｌＨＳＡ的球狀心形結(jié)構(gòu)使其具有較好的彈性，但是當(dāng)與其他分子結(jié)合時，其形逡逑狀會根據(jù)結(jié)合的分子不同而產(chǎn)生不同的變化，例如白蛋白與藥物結(jié)合后的結(jié)構(gòu)改逡逑變能夠影響藥物在體內(nèi)的分布和清除，因此ＨＳＡ在臨床治療方面具有重要作用。逡逑ＨＳＡ中一共有３５個Ｃｙｓ

因此這兩種酶都能促進ｈｒ的效率。逡逑除ＨＲ外，機體內(nèi)還存在另外一種重要的ＤＮＡ損傷修復(fù)方式，那便是非同逡逑源末端連接（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｅｎｄ邋ｊｏｉｎｉｎｇ，邋ＮＨＥＪ），修復(fù)過程如圖１－３所示。參逡逑ＮＨＥＪ過程的一種重要的蛋白是Ｋｕ蛋白，該蛋白是Ｋｕ７０和Ｋｕ８０的異二聚體，逡逑用于識別ＤＳＢ。當(dāng)Ｋｕ蛋白識別到ＤＳＢ后，便會結(jié)合到斷裂末端，召集ＤＮＡ－逡逑ＰＫｃｓ邋（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ｓｕｂｕｎｉｔ）通過自淲酸化激活邋ＮＨＥＪ逡逑修復(fù)，而后利用Ａｒｔｅｍｉｓ重組酶加工ＤＮＡ末端，最后通過ＤＮＡ連接酶將處理完逡逑的末端進行連接，達到修復(fù)ＤＮＡ鏈斷裂的目的Ｗ１。與同源重組不同，非同源末逡逑端連接不需要同源模板的參與，利用該過程對ＤＳＢ進行修復(fù)更為簡便，但是也逡逑更容易導(dǎo)致基因的插入、缺失和點突變等錯誤修復(fù)。逡逑？＇－邐５，Ｈ邋Ｔｉｒｇｃｔ邋ｓｅｎｅ邋３，邋Ｈ邋邐逡逑邐ＨＲ邐邋邐ＮＨＥＪ邐逡逑Ｒａｎｄｏｍ邋ｇｅｎｅ邋ｌｏｃｕｓ逡逑邐邋５＞Ｈ邋Ｔａｒｊ�。澹簦遥澹睿邋澹常冗姟义希颍插澹澹澹�

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4 ;水稻種出人血清白蛋白？[N];北京日報;2011年

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