【摘要】：ASF1(Anti-Silencing Factor 1)是一種組蛋白分子伴侶,在哺乳動(dòng)物中具有ASF1A和ASF1B兩個(gè)亞型。在功能方面,對(duì)核小體組裝、DNA損傷修復(fù)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要的意義。然而,當(dāng)前針對(duì)ASF1在小鼠植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能所知甚少。因此,本研究重點(diǎn)探索對(duì)了ASF1在小鼠受精卵發(fā)育過(guò)程以及植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能。首先,我們對(duì)ASF1A和ASF1B在小鼠受精卵中動(dòng)態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)獲取小鼠受精卵各個(gè)發(fā)育階段(受精后2 h、4 h、6 h、8 h、10 h)的細(xì)胞,利用免疫熒光技術(shù)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)蛋白進(jìn)行定量研究。免疫熒光結(jié)果顯示,ASF1A和ASF1B在小鼠受精卵各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),并且隨著雌雄原核的逐漸形成,二者在細(xì)胞核內(nèi)的含量逐漸增加。其次我們通過(guò)免疫熒光以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)ASF1A和ASF1B在小鼠植入前胚胎發(fā)育各個(gè)階段細(xì)胞核內(nèi)的含量以及mRNA總量進(jìn)行了檢測(cè)。免疫熒光結(jié)果顯示,ASF1A和ASF1B在卵子和植入前胚胎各個(gè)階段均有表達(dá),但具有不同的變化動(dòng)態(tài)。ASF1A細(xì)胞核中的含量在桑椹胚階段最低,而ASF1B在四細(xì)胞階段細(xì)胞核中的含量最低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,AF1A和ASF1B mRNA總量在受精后顯著減少,在桑椹胚階段出現(xiàn)表達(dá)高峰。此外ASF1B mRNA總量在合子階段也處于較高水平。接著,我們對(duì)ASF1在小鼠植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能進(jìn)行了研究。利用ASF1A和ASF1B特異性的siRNA以及Morpholino(MO)分別從轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯水平對(duì)ASF1A和ASF1B進(jìn)行了敲減,進(jìn)一步研究ASF1在小鼠植入前胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ASF1A敲低對(duì)小鼠植入前胚胎發(fā)育影響很小,但ASF1B敲低導(dǎo)致小鼠植入前胚胎發(fā)育率顯著降低。最后,因?yàn)锳SF1B的敲低會(huì)導(dǎo)致植入前胚胎發(fā)育率顯著降低,并且先前研究表明ASF1對(duì)H3K56具有乙酰化作用。因此我們通過(guò)MO將ASF1B進(jìn)行敲低,收集囊胚,利用免疫熒光技術(shù),探究H3K56乙酰化水平的變化狀況。結(jié)果表明,ASF1B的敲低會(huì)導(dǎo)致囊胚階段組蛋白H3K56乙酰化水平降低。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q344
【圖文】：

內(nèi)蒙古大學(xué) 碩士學(xué)位論文谷氨酸殘基）。其他核蛋白，如 HMG 蛋白和 Rad6 蛋白，在10]。這些蛋白參與核小體組裝和拆卸、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和 DNA 谷氨酸可以在一定離子強(qiáng)度下組裝核小體。這個(gè)高酸性區(qū)域他非組蛋白之間的作用來(lái)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。另外 TLK 磷酸守性的 C 末端部分[11,12]。但是這些特征在其他真核生物中 ASF1 的 C 末端區(qū)域完全缺乏。表明 C 末端的高酸性區(qū)域

通過(guò)與 PCNA 相互作用將組蛋白組沉積到 DNA（圖1.3A）[17,18]。從 Hela 細(xì)胞核的提取物中分離出了 CAF-1，由三個(gè)亞基構(gòu)成的組蛋白 H3-H4 伴侶分子。在體外，CAF-1 能夠把組蛋白組裝到正在復(fù)制的 DNA 上[19]。在芽殖酵母細(xì)胞中，AB

圖 1.4 ASF1 在 DNA 損傷應(yīng)答過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化[43] DDC2-Mec1 識(shí)別 DNA 損傷后，Mec1 對(duì) Rad53 進(jìn)行磷酸化，導(dǎo)致 Rad53 與 ASF1 解離，Rad53 又度磷酸化。而 PP2C 能夠使 Rad53 去磷酸化，使去磷酸化的 Rad53 又重新與 ASF1 相結(jié)合。如果損存在，Mec1 可以重新磷酸化 Rad53，并導(dǎo)致與 ASF1 解離和活化。與此同時(shí)，ASF1 結(jié)合組蛋白 H Rtt109 和 Rtt101 進(jìn)行修飾，促進(jìn) H3-H4 的轉(zhuǎn)移到 CAF-1，參與核小體組裝，釋放 ASF1，使其與d53 重新結(jié)合。Figure 1.4 Dynamic change ofASF1 during DNAdamage responseter a DDC2 Mec1 recognizes DSB, Mec1 phosphorylates Rad53, leading to Rad53 dissociation from Ad53 then undergoes hyperphosphorylation. PP2C dephosphorylates Rad53, and the dephosphorylated Radociates with Asf1. If the damage persists, Mec1 can re-phosphorylate Rad53 and lead to dissociation fromdre-activation.Inparallel,Asf1boundhistoneH3undergoesmodificationsbyRtt109andRtt101,whichfaci hand off of the H3 H4 histone dimer to CAF1, freeingAsf1 to re-interact with Rad53.

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