【摘要】：鏈霉菌是一種G+細(xì)菌,能夠合成多種次級代謝產(chǎn)物,例如抗生素、抗腫瘤物質(zhì)等。天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)作為鏈霉菌屬中模式菌株,其基因組已于2002年完成測序,序列分析揭示了其基因組內(nèi)有許多天然物質(zhì)的生物合成基因集群,例如放線紫紅素(Actinorhodin)簡寫為ACT、十一烷基靈菌紅素(Undecylprodigiosin)簡寫為 RED、鈣依賴性抗生素(Calcium-dependent antibiotic)簡寫為CDA等的生物合成基因簇。通過整體性調(diào)控因子進(jìn)行整體調(diào)控從而合成這些天然產(chǎn)物,而目前這些調(diào)控機(jī)制尚不明確。IclR家族廣泛分布于G+細(xì)菌中,具有多種重要的調(diào)控功能。SC02832是天藍(lán)色鏈霉菌M145基因組中一個假定IclR家族蛋白,其功能至今未被闡明。本論文對天藍(lán)色鏈霉菌M145假定調(diào)控蛋白SC02832功能進(jìn)行了初步探索,旨在探討這個轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)SC02832對天藍(lán)色鏈霉菌M145生理過程的調(diào)控機(jī)制和原理。首先通過PCR-targerting方法構(gòu)建敲除質(zhì)粒,采用接合轉(zhuǎn)移法獲得缺失調(diào)控基因sco2832的突變菌株△2832。將M145與A2832進(jìn)行表型分析,發(fā)現(xiàn)△2832的ACT、RED以及CDA的產(chǎn)量均有不同程度的減少。通過相對定量測定實驗對M145與△2832中的ACT、RED、CDA的產(chǎn)量差異進(jìn)行了驗證。為了證明是因為缺失sco2832基因而導(dǎo)致了突變菌株A2832發(fā)生了表型變化,利用整合載體pMS82,攜帶sco2832完整編碼序列和其啟動子區(qū)域,回補(bǔ)A2832獲得回補(bǔ)菌株C-A2832。表型分析發(fā)現(xiàn)回補(bǔ)菌株的生長發(fā)育以及次生代謝產(chǎn)物的生物合成情況接近M145,證明A2832的表型變化是由sco2832的缺失引起的。為了確定SC02832的調(diào)控基因群,對培養(yǎng)至72h的M145與A2832進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析進(jìn)而尋找調(diào)控蛋白SC02832所調(diào)控的基因集群。結(jié)果表明SC02832調(diào)控25 1個基因的轉(zhuǎn)錄,在其中與ACT、RED等生物合成相關(guān)的基因表達(dá)量顯著減少,與CDA生物合成的相關(guān)基因以及和形態(tài)發(fā)育相關(guān)的多個基因簇如chp、ram、、rdl的表達(dá)也為下調(diào)。利用Realtime-PCR對部分基因的表達(dá)進(jìn)行了定量分析,分析成果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)論一致。說明SC02832對ACT、RED的生物合成是負(fù)調(diào)控機(jī)制,對CDA生產(chǎn)中的途徑特異性激活基因sco3217(cdaR)的轉(zhuǎn)錄也為負(fù)調(diào)控。為進(jìn)一步研究SCO2832的保守結(jié)合序列,我們使用表達(dá)載體pET22b表達(dá)載體對SCO2832進(jìn)行了異源表達(dá),獲得了純化的His-SCO2832融合蛋白。綜合以上實驗數(shù)據(jù)結(jié)果,本研究發(fā)現(xiàn)IclR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白SCO2832全局性地調(diào)控天藍(lán)色鏈霉菌的生長發(fā)育與次級代謝產(chǎn)物ACT、RED、CDA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

天藍(lán)色鏈霉菌的生長周期為鏈霉菌的典型代表，其生長發(fā)育過程含有基生菌逡逑絲期、氣生菌絲期、孢子絲期三個循環(huán)的過程［｜｜］。天藍(lán)色鏈霉菌的生長周期示逡逑意圖如圖１－２所示，指示不同時期菌絲體的形態(tài)和位置不同。其生長周期先是逡逑伸出基生菌絲，然后分化成具有繁殖功能的氣生菌絲，隨后在惡劣條件下形成逡逑孢子。當(dāng)孢子擺脫惡劣的環(huán)境并碰到合適的條件就會萌發(fā)然后生出根管，其根逡逑２逡逑

操縱子的轉(zhuǎn)錄＝逡逑目前有５種可用的丨ｃｌＲ蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，其中包括來自海棲熱抱菌逡逑ＴＭ００６５的全蛋白質(zhì)如圖１－４所示，兩種乙醛酸調(diào)節(jié)蛋白的效應(yīng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但逡逑獲得的所有結(jié)構(gòu)都沒有結(jié)合的ＤＮＡ和效應(yīng)子。天藍(lán)色鏈球菌和灰色鏈霉菌的逡逑■ｗｇｊ突變體能夠形成明顯正常的營養(yǎng)隔膜，但其在仍在孢子形成中產(chǎn)生缺陷，逡逑６逡逑

ＬＢ培養(yǎng)基（Ａｍｐ、Ｋｍ、Ｃｍｌ、Ａｐｒ）內(nèi)繼續(xù)輝育，直至其液體的ＯＤ６00值到達(dá)０．６逡逑上下。然后把培養(yǎng)液倒入５０ｍＬＥＰ管內(nèi)，５０００ｒｐｍ離心ｌＯｍｉｎ后回收菌體，使逡逑用不添加任何抗生素的ＬＢ漂洗沉淀后，倒掉上清液，加５００邐ＬＢ培養(yǎng)基重新逡逑懸浮并使用移液器吹打均勻放置備用。逡逑吸取含有數(shù)量約１０６個Ｍ１４５孢子的保藏液，１３０００ｒｐｍ離心２ｍｉｎ，去掉甘逡逑油溶液，使用２ｘＹＴ培養(yǎng)基對孢子進(jìn)行２次洗滌，將其懸浮在５００邋ｐＬ２ｘＹＴ培養(yǎng)逡逑基中，先用５０°Ｃ熱激１０邋ｍｉｎ，再使用冷水流動或者冰浴到常溫。將制備好的５００逡逑ＨＬ感受態(tài)懸液以及５００邋ｐＬ己萌發(fā)的鏈霉菌懸液混合到２邋ｍＬＥＰ管中，不停地混逡逑合均勻，再涂布到含２邋Ｍｍ邋Ｍｇ２＊的ＭＳ－Ｇ培養(yǎng)基表面，在超凈工作臺中送風(fēng)，表逡逑面干燥后把其翻轉(zhuǎn)過來在３０°Ｃ恒溫箱中孵育１４－１８ｈ，進(jìn)行覆蓋實驗。取１邋ｍＬ水逡逑溶液（Ａｐｒ、Ｎａｄｉ）均勻覆蓋在長有菌體的培養(yǎng)基上方，超凈工作臺中垂直送風(fēng)逡逑３０邋ｍｉｎ以上再將其翻轉(zhuǎn)并在３（ＴＣ培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育２－３邋ｄ，雙交換片段過程像圖逡逑２－１示意，觀察平板表面是否產(chǎn)生接合轉(zhuǎn)移單克隆。逡逑Ｅ．ｃｏｌｉ邋ＥＴ１２５６７邋■＇邋ｐＵＺ８Ｑ０２！邋ｃｏｓｍｉｄ逡逑

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1 張紫茜;天藍(lán)色鏈霉菌IclR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白SCO2832的功能初步研究[D];山東大學(xué);2019年

本文編號：2753575