【摘要】：開(kāi)花植物有性生殖的主要特征是精細(xì)胞與卵細(xì)胞及中央細(xì)胞的雙受精過(guò)程。雌雄配子體的發(fā)育對(duì)于雙受精過(guò)程的順利進(jìn)行至關(guān)重要。其中小孢子母細(xì)胞與大孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的減數(shù)分裂及有絲分裂過(guò)程分別產(chǎn)生雄配子與雌配子。研究表明,有絲分裂過(guò)程的異常往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,這暗示著有絲分裂的調(diào)控對(duì)于配子體的發(fā)育過(guò)程至關(guān)重要。在核糖體合成異常的突變體中,許多配子體致死都是由于有絲分裂缺陷導(dǎo)致。人們根據(jù)同源比對(duì)在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的核糖體蛋白(Ribosomal Proteins,RPs),但是關(guān)于這些蛋白是如何被調(diào)控的,比如動(dòng)態(tài)的亞細(xì)胞靶向過(guò)程,目前還尚不清楚。在本研究中,我們鑒定了一個(gè)擬南芥importinβ蛋白家族成員KETCH1,通過(guò)介導(dǎo)核糖體蛋白L27a(RPL27a)的核積累,參與調(diào)控配子體的發(fā)育。本論文的主要研究成果和結(jié)論如下:(1)KETCH1功能缺失導(dǎo)致雌雄配子體傳代率下降已有研究表明,KETCH1功能缺失會(huì)造成純合致死,得不到純合體植株(Zhang et al.,2017)。我們用野生型Col-0作為對(duì)照,對(duì)ketch1-2/+進(jìn)行育性分析,發(fā)現(xiàn)雜合突變體角果中有47%的敗育胚珠,敗育率顯著高于胚致死的25%。此外,ketch1-2/+中小而皺縮的胚珠是未受精的,胚囊中含有不規(guī)則分布的細(xì)胞核。正反交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ketch1-2的雌雄配子體傳代率均顯著降低,表明KETCH1對(duì)于雌雄配子體的功能至關(guān)重要。(2)KETCH1功能缺失導(dǎo)致單細(xì)胞小孢子和功能大孢子發(fā)育停滯為了確定雄配子體傳代率降低的原因,我們通過(guò)亞歷山大染色、DAPI染色以及掃描電鏡觀察對(duì)花粉的活性、核發(fā)育及外壁形態(tài)進(jìn)行了觀察。與野生型相比,ketch1-2/+中有32%左右的花粉敗育。我們通過(guò)半薄切片觀察了不同發(fā)育時(shí)期的花藥。在發(fā)育的第10期,突變體與野生型相比,花粉發(fā)育并沒(méi)有任何異常。然而第11期開(kāi)始出現(xiàn)異常,突變體小孢子只含有一個(gè)細(xì)胞核并且有許多異常的大液泡存在,暗示了ketch1-2小孢子的第一次有絲分裂出現(xiàn)異常。為了確定雌配子體發(fā)育異常,我們通過(guò)組織光學(xué)切片對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的胚珠進(jìn)行觀察。ketch1-2/+在3-I時(shí)期可以正常形成功能大孢子,但是有30%左右的功能大孢子有絲分裂過(guò)程出現(xiàn)異常,導(dǎo)致突變體成熟胚囊中細(xì)胞核數(shù)目呈現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài),從1個(gè)到6個(gè)不等。這些結(jié)果證明,KETCH1對(duì)于單細(xì)胞小孢子和功能大孢子發(fā)育過(guò)程中的第一次有絲分裂極為重要。(3)KETCH1組成型表達(dá),并且在生殖組織中高量表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果以及KETCH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因株系均顯示KETCH1是組成型表達(dá),并且在生殖組織如花序、胚珠及花粉中高量表達(dá)。通過(guò)分析KETCH1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核靶向熒光蛋白YFP的轉(zhuǎn)基因株系,表明KETCH1在配子體發(fā)育過(guò)程中的生殖細(xì)胞中高量表達(dá)。(4)KETCH1在配子體發(fā)育過(guò)程中的功能并不依賴(lài)HYL1之前的研究報(bào)道顯示,KETCH1能夠介導(dǎo)miRNA的關(guān)鍵調(diào)控因子HYL1的核質(zhì)穿梭過(guò)程。盡管HYL1功能缺失突變會(huì)導(dǎo)致植株育性下降,但是我們的結(jié)果表明,hyl1-2雌雄配子體傳代率與野生型相比沒(méi)有差異,這說(shuō)明HYL1并不參與KETCH1介導(dǎo)的配子體發(fā)育過(guò)程。(5)RPL27aC在細(xì)胞核中的積累需要KETCH1的運(yùn)輸根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞同源蛋白IPO5的研究結(jié)果顯示,KETCH1可能參與核糖體蛋白的核輸入過(guò)程。通過(guò)BiFC和體外pull-down實(shí)驗(yàn),證明KETCH1與RPL27aC互作。而且我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了核輸入蛋白與底物分子的結(jié)合是特異的。并且在ketch1-2背景下,RPL27aC在花粉及花粉管的細(xì)胞核中的積累量顯著降低,同樣的在KETCH1-RNAi植株的葉片原生質(zhì)體中,RPL27aC核積累量也是降低的,這表明RPL27aC是KETCH1的底物蛋白。已有研究表明,RPL27a功能缺失突變會(huì)導(dǎo)致雌雄配子體傳代率顯著下降,這與它在KETCH1調(diào)控的配子發(fā)生中的功能相一致。因此,KETCH1很有可能是通過(guò)介導(dǎo)RPL27a的核積累來(lái)調(diào)控核糖體生物發(fā)生過(guò)程,進(jìn)而調(diào)控配子發(fā)生期間的有絲分裂過(guò)程。核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類(lèi)介導(dǎo)核質(zhì)穿梭的分子伴侶。本論文結(jié)果顯示,擬南芥核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KETCH1功能缺失導(dǎo)致減數(shù)分裂后的雌雄配子體發(fā)育停滯。同時(shí)我們證明了KETCH1在配子體發(fā)育過(guò)程中的功能并不依賴(lài)已報(bào)道的底物HYL1。相反的,KETCH1對(duì)RPL27a的核積累至關(guān)重要,并且RPL27a的突變導(dǎo)致了類(lèi)似的配子體缺陷。因此我們推測(cè),核糖體蛋白核積累的減少可能導(dǎo)致了細(xì)胞翻譯能力下降,進(jìn)而在配子發(fā)生過(guò)程中觸發(fā)有絲分裂細(xì)胞周期的停滯。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥雄配子體發(fā)育過(guò)程示意圖（McCormick, 2004）Fig. 1-1 Schematic of the development of Arabidopsis male gametophyte研究中，人們根據(jù)花藥每個(gè)發(fā)育時(shí)期進(jìn)行的具有代表性花藥發(fā)育分為 14 個(gè)時(shí)期（Sanders et al., 1999），花藥發(fā)究意義。經(jīng)過(guò)復(fù)雜而精細(xì)的發(fā)育過(guò)程，形成了具有兩種胞和精細(xì)胞的雄性生殖系（Berger and Twell, 2011）。的發(fā)育雌配子體是卵細(xì)胞產(chǎn)生和雙受精過(guò)程進(jìn)行的重要結(jié)構(gòu)，的作用（Drews and Yadegari, 2002; Sprunck et al., 2011）管的吸引及導(dǎo)向性生長(zhǎng)過(guò)程（Hulskamp et al., 1995）。囊結(jié)構(gòu)都是蓼型胚囊，因其第一次在蓼屬植物中被描述而4）。

擬南芥 KETCH1 通過(guò)介導(dǎo)核糖體蛋白 RPL27a 的核積累調(diào)控配子體發(fā)育的功能大孢子的選擇（Christensen et al., 1998; Drews and Koltunow, 2011）。在雌配子形成過(guò)程中，位于合點(diǎn)端的單核功能大孢子細(xì)胞體積不斷增大，經(jīng)過(guò)兩次核分裂的有絲分裂過(guò)程形成四核細(xì)胞，胚囊兩端各有兩個(gè)核，此過(guò)程細(xì)胞質(zhì)不進(jìn)行分裂，在第三次有絲分裂進(jìn)行完之后，各個(gè)核之間形成細(xì)胞板，每個(gè)細(xì)胞完全被細(xì)胞壁包圍而互相分離，然后兩端各有一個(gè)細(xì)胞核移向發(fā)育中的雌配子中央，融合形成中央細(xì)胞，最終形成七細(xì)胞八核的胚囊結(jié)構(gòu)（Christensen et al., 1998; Drews et al., 1998; Drews and Koltunow, 2011;Liu et al., 2019）。其中珠孔端的三個(gè)核，一個(gè)分化為卵細(xì)胞，另外兩個(gè)分化為助細(xì)胞，合點(diǎn)端的三個(gè)核分化為三個(gè)反足細(xì)胞，胚囊中央的兩個(gè)核細(xì)胞融合成為中央細(xì)胞，至此，配子體發(fā)生過(guò)程結(jié)束，成熟的雌配子體形成（Drews et al., 1998），如圖 1-2 所示。

圖 1-3 擬南芥的雙受精過(guò)程示意圖（Sprunck and Dresselhaus, 2015）Fig. 1-3 Schematic of an Arabidopsis double fertilization process在整個(gè)受精過(guò)程中，助細(xì)胞被認(rèn)為是作為一種協(xié)助細(xì)胞，對(duì)花粉管的吸引和精子的釋放起主導(dǎo)作用（Dresselhaus and Franklin-Tong, 2013）。模式植物擬南芥在受精過(guò)程中通常只有一根花粉管能夠進(jìn)入胚珠并釋放精細(xì)胞，花粉管與其中一個(gè)助細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)交流并完成受精過(guò)程，同時(shí)伴隨著該助細(xì)胞的降解，如果受精過(guò)程失敗，另外一個(gè)助細(xì)胞會(huì)繼續(xù)釋放吸引信號(hào)使其他花粉管進(jìn)入胚珠完成受精過(guò)程（Beale et al., 2012; Kasahara etal., 2012）。另外有研究報(bào)道，為了避免多個(gè)花粉管進(jìn)入胚囊中，助細(xì)胞可以與受精后的中央細(xì)胞融合，巨大的中央細(xì)胞可以使花粉管引誘劑迅速被稀釋?zhuān)ǚ酃芪盘?hào)停止釋放，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為協(xié)同胚乳融合（Maruyama et al., 2015）（圖 1-3）�；ǚ酃芎团咧橹g密切的細(xì)胞間相互作用是雙受精過(guò)程的重要保障（Marton and Dresselhaus, 2010; Quet al., 2015; Li et al., 2018）。

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本文編號(hào)：2753430