【摘要】：開花植物有性生殖的主要特征是精細胞與卵細胞及中央細胞的雙受精過程。雌雄配子體的發(fā)育對于雙受精過程的順利進行至關(guān)重要。其中小孢子母細胞與大孢子母細胞經(jīng)過一系列的減數(shù)分裂及有絲分裂過程分別產(chǎn)生雄配子與雌配子。研究表明,有絲分裂過程的異常往往會導(dǎo)致細胞死亡,這暗示著有絲分裂的調(diào)控對于配子體的發(fā)育過程至關(guān)重要。在核糖體合成異常的突變體中,許多配子體致死都是由于有絲分裂缺陷導(dǎo)致。人們根據(jù)同源比對在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的核糖體蛋白(Ribosomal Proteins,RPs),但是關(guān)于這些蛋白是如何被調(diào)控的,比如動態(tài)的亞細胞靶向過程,目前還尚不清楚。在本研究中,我們鑒定了一個擬南芥importinβ蛋白家族成員KETCH1,通過介導(dǎo)核糖體蛋白L27a(RPL27a)的核積累,參與調(diào)控配子體的發(fā)育。本論文的主要研究成果和結(jié)論如下:(1)KETCH1功能缺失導(dǎo)致雌雄配子體傳代率下降已有研究表明,KETCH1功能缺失會造成純合致死,得不到純合體植株(Zhang et al.,2017)。我們用野生型Col-0作為對照,對ketch1-2/+進行育性分析,發(fā)現(xiàn)雜合突變體角果中有47%的敗育胚珠,敗育率顯著高于胚致死的25%。此外,ketch1-2/+中小而皺縮的胚珠是未受精的,胚囊中含有不規(guī)則分布的細胞核。正反交實驗結(jié)果顯示,ketch1-2的雌雄配子體傳代率均顯著降低,表明KETCH1對于雌雄配子體的功能至關(guān)重要。(2)KETCH1功能缺失導(dǎo)致單細胞小孢子和功能大孢子發(fā)育停滯為了確定雄配子體傳代率降低的原因,我們通過亞歷山大染色、DAPI染色以及掃描電鏡觀察對花粉的活性、核發(fā)育及外壁形態(tài)進行了觀察。與野生型相比,ketch1-2/+中有32%左右的花粉敗育。我們通過半薄切片觀察了不同發(fā)育時期的花藥。在發(fā)育的第10期,突變體與野生型相比,花粉發(fā)育并沒有任何異常。然而第11期開始出現(xiàn)異常,突變體小孢子只含有一個細胞核并且有許多異常的大液泡存在,暗示了ketch1-2小孢子的第一次有絲分裂出現(xiàn)異常。為了確定雌配子體發(fā)育異常,我們通過組織光學(xué)切片對不同發(fā)育時期的胚珠進行觀察。ketch1-2/+在3-I時期可以正常形成功能大孢子,但是有30%左右的功能大孢子有絲分裂過程出現(xiàn)異常,導(dǎo)致突變體成熟胚囊中細胞核數(shù)目呈現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài),從1個到6個不等。這些結(jié)果證明,KETCH1對于單細胞小孢子和功能大孢子發(fā)育過程中的第一次有絲分裂極為重要。(3)KETCH1組成型表達,并且在生殖組織中高量表達熒光定量PCR結(jié)果以及KETCH1啟動子驅(qū)動GUS報告基因的轉(zhuǎn)基因株系均顯示KETCH1是組成型表達,并且在生殖組織如花序、胚珠及花粉中高量表達。通過分析KETCH1啟動子驅(qū)動核靶向熒光蛋白YFP的轉(zhuǎn)基因株系,表明KETCH1在配子體發(fā)育過程中的生殖細胞中高量表達。(4)KETCH1在配子體發(fā)育過程中的功能并不依賴HYL1之前的研究報道顯示,KETCH1能夠介導(dǎo)miRNA的關(guān)鍵調(diào)控因子HYL1的核質(zhì)穿梭過程。盡管HYL1功能缺失突變會導(dǎo)致植株育性下降,但是我們的結(jié)果表明,hyl1-2雌雄配子體傳代率與野生型相比沒有差異,這說明HYL1并不參與KETCH1介導(dǎo)的配子體發(fā)育過程。(5)RPL27aC在細胞核中的積累需要KETCH1的運輸根據(jù)動物細胞同源蛋白IPO5的研究結(jié)果顯示,KETCH1可能參與核糖體蛋白的核輸入過程。通過BiFC和體外pull-down實驗,證明KETCH1與RPL27aC互作。而且我們的實驗結(jié)果也證明了核輸入蛋白與底物分子的結(jié)合是特異的。并且在ketch1-2背景下,RPL27aC在花粉及花粉管的細胞核中的積累量顯著降低,同樣的在KETCH1-RNAi植株的葉片原生質(zhì)體中,RPL27aC核積累量也是降低的,這表明RPL27aC是KETCH1的底物蛋白。已有研究表明,RPL27a功能缺失突變會導(dǎo)致雌雄配子體傳代率顯著下降,這與它在KETCH1調(diào)控的配子發(fā)生中的功能相一致。因此,KETCH1很有可能是通過介導(dǎo)RPL27a的核積累來調(diào)控核糖體生物發(fā)生過程,進而調(diào)控配子發(fā)生期間的有絲分裂過程。核轉(zhuǎn)運蛋白是一類介導(dǎo)核質(zhì)穿梭的分子伴侶。本論文結(jié)果顯示,擬南芥核轉(zhuǎn)運蛋白KETCH1功能缺失導(dǎo)致減數(shù)分裂后的雌雄配子體發(fā)育停滯。同時我們證明了KETCH1在配子體發(fā)育過程中的功能并不依賴已報道的底物HYL1。相反的,KETCH1對RPL27a的核積累至關(guān)重要,并且RPL27a的突變導(dǎo)致了類似的配子體缺陷。因此我們推測,核糖體蛋白核積累的減少可能導(dǎo)致了細胞翻譯能力下降,進而在配子發(fā)生過程中觸發(fā)有絲分裂細胞周期的停滯。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥雄配子體發(fā)育過程示意圖（McCormick, 2004）Fig. 1-1 Schematic of the development of Arabidopsis male gametophyte研究中，人們根據(jù)花藥每個發(fā)育時期進行的具有代表性花藥發(fā)育分為 14 個時期（Sanders et al., 1999），花藥發(fā)究意義。經(jīng)過復(fù)雜而精細的發(fā)育過程，形成了具有兩種胞和精細胞的雄性生殖系（Berger and Twell, 2011）。的發(fā)育雌配子體是卵細胞產(chǎn)生和雙受精過程進行的重要結(jié)構(gòu)，的作用（Drews and Yadegari, 2002; Sprunck et al., 2011）管的吸引及導(dǎo)向性生長過程（Hulskamp et al., 1995）。囊結(jié)構(gòu)都是蓼型胚囊，因其第一次在蓼屬植物中被描述而4）。

擬南芥 KETCH1 通過介導(dǎo)核糖體蛋白 RPL27a 的核積累調(diào)控配子體發(fā)育的功能大孢子的選擇（Christensen et al., 1998; Drews and Koltunow, 2011）。在雌配子形成過程中，位于合點端的單核功能大孢子細胞體積不斷增大，經(jīng)過兩次核分裂的有絲分裂過程形成四核細胞，胚囊兩端各有兩個核，此過程細胞質(zhì)不進行分裂，在第三次有絲分裂進行完之后，各個核之間形成細胞板，每個細胞完全被細胞壁包圍而互相分離，然后兩端各有一個細胞核移向發(fā)育中的雌配子中央，融合形成中央細胞，最終形成七細胞八核的胚囊結(jié)構(gòu)（Christensen et al., 1998; Drews et al., 1998; Drews and Koltunow, 2011;Liu et al., 2019）。其中珠孔端的三個核，一個分化為卵細胞，另外兩個分化為助細胞，合點端的三個核分化為三個反足細胞，胚囊中央的兩個核細胞融合成為中央細胞，至此，配子體發(fā)生過程結(jié)束，成熟的雌配子體形成（Drews et al., 1998），如圖 1-2 所示。

圖 1-3 擬南芥的雙受精過程示意圖（Sprunck and Dresselhaus, 2015）Fig. 1-3 Schematic of an Arabidopsis double fertilization process在整個受精過程中，助細胞被認為是作為一種協(xié)助細胞，對花粉管的吸引和精子的釋放起主導(dǎo)作用（Dresselhaus and Franklin-Tong, 2013）。模式植物擬南芥在受精過程中通常只有一根花粉管能夠進入胚珠并釋放精細胞，花粉管與其中一個助細胞進行信號交流并完成受精過程，同時伴隨著該助細胞的降解，如果受精過程失敗，另外一個助細胞會繼續(xù)釋放吸引信號使其他花粉管進入胚珠完成受精過程（Beale et al., 2012; Kasahara etal., 2012）。另外有研究報道，為了避免多個花粉管進入胚囊中，助細胞可以與受精后的中央細胞融合，巨大的中央細胞可以使花粉管引誘劑迅速被稀釋，花粉管吸引信號停止釋放，這種現(xiàn)象被稱為協(xié)同胚乳融合（Maruyama et al., 2015）（圖 1-3）。花粉管和胚珠之間密切的細胞間相互作用是雙受精過程的重要保障（Marton and Dresselhaus, 2010; Quet al., 2015; Li et al., 2018）。

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本文編號：2753430