發(fā)布時間：2020-07-13 05:11

【摘要】：在沒有必要進行全基因組測序的情況下,利用基因組步移技術(shù)獲取已知序列的未知側(cè)翼區(qū)域,是多數(shù)實驗室的選擇。目前已建立多種PCR基的基因組步移方法。我們前期建立了重疊子為10 bp的引物部分重疊PCR(Partially overlapping primer-based PCR,POP-PCR),用于基因組步移。POP-PCR不需要進行任何其它操作,是一種實用性強的方法。本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,建立了9-bp與15-bp重疊子POP-PCR;研發(fā)了12-bp重疊子POP-PCR基因組步移試劑盒,并對其可行性進行了測試。主要研究結(jié)果如下:1、設(shè)計了9-bp與15-bp重疊子POP引物組各兩組,每組POP引物由三條引物構(gòu)成[POP-P(用于第一輪PCR)、POP-S(用于第二輪PCR)、POP-T(用于第三輪PCR)],其3’-端具有9-或15-bp的一致序列(即重疊子)。由于重疊子較短,后一輪POP引物的3’-端重疊子僅能在較低溫度下退火至與前一輪PCR產(chǎn)物的重疊子位點。每個POP引物組的三條引物分別與三條特異性引物配套使用,進行三輪巢式PCR反應(yīng),用于獲取已知序列的側(cè)翼區(qū)域。每輪PCR中,最初的5個高嚴謹循環(huán)使特異性引物與已知序列內(nèi)的互補位點結(jié)合,并向未知序列方向延伸,形成一系列目標單鏈;在隨后一個僅有的低嚴謹循環(huán)中,隨機引物與模板發(fā)生部分退火,形成5’-端含有POP引物的單鏈DNA池,其中目標單鏈的3’-端與特異性引物完全互補,而非目標單鏈不存在任何引物的完美退火位點。在接下來的1個高嚴謹循環(huán)中,目標單鏈在特異性引物的引導下轉(zhuǎn)變成雙鏈(兩個3’-端分別與特異性引物或POP引物完全互補),在此后的高嚴謹循環(huán)中,目標DNA分子被特異性引物與步移引物,按照常規(guī)特異性擴增模式進行指數(shù)擴增;非目標單鏈由于缺乏任何引物的完整互補位點,始終不能轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA,因而不能擴增。利用POP-PCR對短乳桿菌NCL912的谷氨酸脫羧酶基因(gadA)位點,以及插入了潮霉素基因(hgy)的水稻基因組進行步移。結(jié)果表明,所有POP-PCR都可以獲得清晰的目的片段,平均長度達1.5 kb。2、設(shè)計了12-bp重疊子POP-PCR基因組步移試劑盒。詳細介紹了試劑盒的構(gòu)成與操作方法,并利用陽性對照模板和人基因組模板對試劑盒進行了驗證。結(jié)果表明,試劑盒能高效進行基因組步移,并具有通用性。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

第 1 章 引言8年，Ochman等[45]與Triglia等[46]率先提出反向PCR（Inverse 組步移，用于獲取已知序列的側(cè)翼。該方法的基本原理如圖內(nèi)切酶對基因組 DNA 進行酶切處理，然后利用連接酶對已知序列兩端的未知區(qū)域被連接在一起，在已知序列的兩相反的引物，然后通過常規(guī) PCR 可以擴增得到未知序列。引物的延伸方向是相對的，所擴增的區(qū)域為兩條引物包圍PCR 中，由于所設(shè)計的引物的擴增方向相反，所擴增的區(qū)域知序列，所以被稱作反向 PCR。以考慮對連接后的環(huán)形 DNA 再次進行酶切，但是酶切位且介于兩條引物之間，同時在不能在未知區(qū)域有該酶的酶擴增不成功。

需要對未知序列的方向進行分析，根據(jù)酶切位點，以及已知列的方向，可以確定未知序列的上下游關(guān)系。.2.2 DNA 末端修飾法這些方法涉及基因組 DNA 的限制性內(nèi)切，以及隨后的末端修飾，如與雙盒式 DNA（double-stranded DNA cassette）[有時也稱為適配體（adapter）或接頭（linker）]連接，然后利用來源于已知序列的巢式特異性引物和接頭引進行 PCR 擴增[39, 47, 48]。由于特異性與擴增效率不夠，往往需要進行 2 輪甚至巢式 PCR，每輪 PCR 使用前一輪 PCR 產(chǎn)物作為模板。如此，一方面可以加目的產(chǎn)物的擴增量，也能提高擴增的特異性。但由于每輪 PCR 均使用了接引物，被接頭引物包圍的非目的序列往往能得到有效的擴增；而且，雙鏈 DNA可以自連，在 PCR 過程中，會消耗酶活性和 dNTP。因此，該方法仍然面臨異性不高以及目的產(chǎn)物量可能不夠的問題（圖 1.2）。

T-接頭PCR示意圖

【相似文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 謝茜;不同長度重疊子POP-PCR基因組步移技術(shù)建立與試劑盒設(shè)計[D];南昌大學;2019年

本文編號：2753007