【摘要】：在沒(méi)有必要進(jìn)行全基因組測(cè)序的情況下,利用基因組步移技術(shù)獲取已知序列的未知側(cè)翼區(qū)域,是多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的選擇。目前已建立多種PCR基的基因組步移方法。我們前期建立了重疊子為10 bp的引物部分重疊PCR(Partially overlapping primer-based PCR,POP-PCR),用于基因組步移。POP-PCR不需要進(jìn)行任何其它操作,是一種實(shí)用性強(qiáng)的方法。本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,建立了9-bp與15-bp重疊子POP-PCR;研發(fā)了12-bp重疊子POP-PCR基因組步移試劑盒,并對(duì)其可行性進(jìn)行了測(cè)試。主要研究結(jié)果如下:1、設(shè)計(jì)了9-bp與15-bp重疊子POP引物組各兩組,每組POP引物由三條引物構(gòu)成[POP-P(用于第一輪PCR)、POP-S(用于第二輪PCR)、POP-T(用于第三輪PCR)],其3’-端具有9-或15-bp的一致序列(即重疊子)。由于重疊子較短,后一輪POP引物的3’-端重疊子僅能在較低溫度下退火至與前一輪PCR產(chǎn)物的重疊子位點(diǎn)。每個(gè)POP引物組的三條引物分別與三條特異性引物配套使用,進(jìn)行三輪巢式PCR反應(yīng),用于獲取已知序列的側(cè)翼區(qū)域。每輪PCR中,最初的5個(gè)高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)使特異性引物與已知序列內(nèi)的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合,并向未知序列方向延伸,形成一系列目標(biāo)單鏈;在隨后一個(gè)僅有的低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)中,隨機(jī)引物與模板發(fā)生部分退火,形成5’-端含有POP引物的單鏈DNA池,其中目標(biāo)單鏈的3’-端與特異性引物完全互補(bǔ),而非目標(biāo)單鏈不存在任何引物的完美退火位點(diǎn)。在接下來(lái)的1個(gè)高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)中,目標(biāo)單鏈在特異性引物的引導(dǎo)下轉(zhuǎn)變成雙鏈(兩個(gè)3’-端分別與特異性引物或POP引物完全互補(bǔ)),在此后的高嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán)中,目標(biāo)DNA分子被特異性引物與步移引物,按照常規(guī)特異性擴(kuò)增模式進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增;非目標(biāo)單鏈由于缺乏任何引物的完整互補(bǔ)位點(diǎn),始終不能轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA,因而不能擴(kuò)增。利用POP-PCR對(duì)短乳桿菌NCL912的谷氨酸脫羧酶基因(gadA)位點(diǎn),以及插入了潮霉素基因(hgy)的水稻基因組進(jìn)行步移。結(jié)果表明,所有POP-PCR都可以獲得清晰的目的片段,平均長(zhǎng)度達(dá)1.5 kb。2、設(shè)計(jì)了12-bp重疊子POP-PCR基因組步移試劑盒。詳細(xì)介紹了試劑盒的構(gòu)成與操作方法,并利用陽(yáng)性對(duì)照模板和人基因組模板對(duì)試劑盒進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明,試劑盒能高效進(jìn)行基因組步移,并具有通用性。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

第 1 章 引言8年，Ochman等[45]與Triglia等[46]率先提出反向PCR（Inverse 組步移，用于獲取已知序列的側(cè)翼。該方法的基本原理如圖內(nèi)切酶對(duì)基因組 DNA 進(jìn)行酶切處理，然后利用連接酶對(duì)已知序列兩端的未知區(qū)域被連接在一起，在已知序列的兩相反的引物，然后通過(guò)常規(guī) PCR 可以擴(kuò)增得到未知序列。引物的延伸方向是相對(duì)的，所擴(kuò)增的區(qū)域?yàn)閮蓷l引物包圍PCR 中，由于所設(shè)計(jì)的引物的擴(kuò)增方向相反，所擴(kuò)增的區(qū)域知序列，所以被稱作反向 PCR。以考慮對(duì)連接后的環(huán)形 DNA 再次進(jìn)行酶切，但是酶切位且介于兩條引物之間，同時(shí)在不能在未知區(qū)域有該酶的酶擴(kuò)增不成功。

需要對(duì)未知序列的方向進(jìn)行分析，根據(jù)酶切位點(diǎn)，以及已知列的方向，可以確定未知序列的上下游關(guān)系。.2.2 DNA 末端修飾法這些方法涉及基因組 DNA 的限制性內(nèi)切，以及隨后的末端修飾，如與雙盒式 DNA（double-stranded DNA cassette）[有時(shí)也稱為適配體（adapter）或接頭（linker）]連接，然后利用來(lái)源于已知序列的巢式特異性引物和接頭引進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[39, 47, 48]。由于特異性與擴(kuò)增效率不夠，往往需要進(jìn)行 2 輪甚至巢式 PCR，每輪 PCR 使用前一輪 PCR 產(chǎn)物作為模板。如此，一方面可以加目的產(chǎn)物的擴(kuò)增量，也能提高擴(kuò)增的特異性。但由于每輪 PCR 均使用了接引物，被接頭引物包圍的非目的序列往往能得到有效的擴(kuò)增；而且，雙鏈 DNA可以自連，在 PCR 過(guò)程中，會(huì)消耗酶活性和 dNTP。因此，該方法仍然面臨異性不高以及目的產(chǎn)物量可能不夠的問(wèn)題（圖 1.2）。

T-接頭PCR示意圖

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 謝茜;不同長(zhǎng)度重疊子POP-PCR基因組步移技術(shù)建立與試劑盒設(shè)計(jì)[D];南昌大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2753007