【摘要】：脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜的固有組成成分,是對(duì)宿主具有一定生物毒性的非分泌性物質(zhì),所以又稱內(nèi)毒素(Endotoxin)。當(dāng)細(xì)菌裂解或死亡,脂多糖便釋放出來(lái),若進(jìn)入血液則能引起機(jī)體發(fā)熱,產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng),是敗血性休克、多器官功能障礙綜合癥等疾病發(fā)生的主要致病因子。脂多糖污染不可避免,常見于食品及飲用水、藥品及醫(yī)療產(chǎn)品中,對(duì)人體健康產(chǎn)生巨大的威脅和危害。因此,篩選特異性的脂多糖識(shí)別分子和拮抗物質(zhì)一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。核酸適配體(Aptamer)因具有親和力高、特異性強(qiáng)、易于修飾、體外合成方便、不需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)等特點(diǎn)已成為近年來(lái)生物識(shí)別分子領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),在安全檢測(cè)、疾病治療、生物分析等方面得到了廣泛的應(yīng)用。本研究采用Capture-SELEX技術(shù)并加以改進(jìn),以鼠傷寒沙門氏菌脂多糖為靶標(biāo)篩選獲得了一條廣譜型脂多糖核酸適配體,然后對(duì)其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪裁優(yōu)化,同時(shí)結(jié)合熒光偏振、圓二色譜、等溫滴定微量熱以及分子模擬等技術(shù)探討了序列結(jié)構(gòu)功能,分析了核酸適配體與脂多糖的結(jié)合機(jī)制,建立了快速、均相的檢測(cè)方法并進(jìn)行了細(xì)胞抗炎性能試驗(yàn),為今后脂多糖的快速檢測(cè)及拮抗分子的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容如下:首先,基于Capture-SELEX技術(shù)建立定向策略篩選獲得了廣譜型脂多糖核酸適配體。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)了一條互補(bǔ)序列作為橋接序列,將ssDNA篩選文庫(kù)固定在合成的磁性納米顆粒上,然后將篩選靶標(biāo)鼠傷寒沙門氏菌脂多糖與其孵育,這樣有親和力、特異性的ssDNA從磁珠上解離下來(lái)與靶標(biāo)形成游離復(fù)合物,通過(guò)磁分離獲得PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增、酶切制備單鏈后進(jìn)行下一輪循環(huán),經(jīng)過(guò)前6輪的正篩、反篩富集后,引入鼠傷寒沙門氏菌等活菌作為定向篩選物質(zhì),再經(jīng)過(guò)9輪的正篩、反篩和定向篩交替篩選后,進(jìn)行克隆測(cè)序以及親和力、特異性試驗(yàn),最終獲得了一條能識(shí)別四種細(xì)菌來(lái)源脂多糖的廣譜型核酸適配體EA7,其K_d值為102±17 nM。其次,為進(jìn)一步驗(yàn)證EA7分子的識(shí)別性能,構(gòu)建了Structure-switching型核酸適配體生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了脂多糖的均相檢測(cè)。在5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)的EA7序列的上游設(shè)計(jì)了一條3’端帶有DABCYL猝滅基團(tuán)標(biāo)記的短互補(bǔ)序列qCS,在沒有靶標(biāo)脂多糖存在的情況下,核酸適配體與qCS結(jié)合,使得FAM與DABCYL相互靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,熒光被猝滅;當(dāng)靶標(biāo)出現(xiàn)后,由于特異性親和力作用,脂多糖取代qCS與EA7結(jié)合,而使EA7結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變,從而互補(bǔ)鏈qCS從EA7上解離下來(lái),FAM與DABCYL相互遠(yuǎn)離,熒光恢復(fù),根據(jù)熒光變化可實(shí)現(xiàn)LPS的均相檢測(cè)。在最優(yōu)條件下,對(duì)鼠傷寒沙門氏菌脂多糖、腸炎沙門氏菌脂多糖、銅綠假單胞菌脂多糖和大腸桿菌脂多糖線性范圍分別為:5-250 ng/mL、0.025-10?g/mL、0.05-5?g/mL、0.1-10?g/mL,最低檢測(cè)限分別為3.0 ng/mL、21.30 ng/mL、47.70 ng/mL、99.31 ng/mL,飲用水加標(biāo)回收率在95.1%-105.1%之間。該方法操作簡(jiǎn)便、無(wú)需分離、靈敏可靠。第三,對(duì)脂多糖廣譜型核酸適配體EA7(為便于編號(hào),重新命名為L(zhǎng)A80)序列結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了剪裁優(yōu)化和分析。根據(jù)核酸適配體的一級(jí)序列和二級(jí)序列結(jié)構(gòu)對(duì)全長(zhǎng)核酸適配體LA80采用兩種剪裁優(yōu)化策略,共獲得7條剪裁序列,然后構(gòu)建了熒光偏振競(jìng)爭(zhēng)法對(duì)其進(jìn)行特異性分析以及利用ITC法進(jìn)行親和性分析,最終通過(guò)優(yōu)化去除了部分多余的序列,確定長(zhǎng)27 bp的核酸適配體LA27為最佳優(yōu)化核酸適配體,它不僅保留了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌脂多糖、銅綠假單胞菌脂多糖和大腸桿菌脂多糖等3種脂多糖的結(jié)合能力,其親和力還提高了約1倍,解離常數(shù)K_d=46.2±9.5 nM。通過(guò)分析,我們認(rèn)為L(zhǎng)A27上5’端的CC和3’端CGA形成的開環(huán)狀部分可能是脂多糖結(jié)合的支撐區(qū),而其余堿基組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)則可能是與脂多糖發(fā)生作用的主要結(jié)合區(qū)。圓二色譜CD結(jié)果進(jìn)一步表明LA27可能以嵌入的方式與脂多糖結(jié)合。第四,建立了基于氧化石墨烯(GO)增強(qiáng)熒光偏振信號(hào)的分析方法快速檢測(cè)脂多糖,以對(duì)LA27在分析檢測(cè)方面的性能進(jìn)一步進(jìn)行分析。利用水浴超聲法制備獲得的氧化石墨烯納米片吸附核酸適配體分子探針,形成GO/aptamer復(fù)合物,熒光偏振信號(hào)迅速增強(qiáng),加入脂多糖后,分子探針從GO上解離下來(lái)與其結(jié)合形成LPS/aptamer復(fù)合物,熒光偏振信號(hào)降低,從而實(shí)現(xiàn)了脂多糖的快速、均相檢測(cè)。結(jié)果表明,在最優(yōu)條件下,LA27對(duì)鼠傷寒沙門氏菌脂多糖、銅綠假單胞菌脂多糖和大腸桿菌脂多糖的檢測(cè)限分別為38.7 ng/mL、88.7 ng/mL、154 ng/mL,比LA80作為分子探針的檢測(cè)限分別提高了4.8、29和18倍;動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明該方法檢測(cè)快速,可在30 min內(nèi)完成檢測(cè)。氯化鈉注射液樣品加標(biāo)回收率在92%-112.5%之間。以上結(jié)果表明剪裁優(yōu)化后的LA27由于序列更短、親和力更好,使其檢測(cè)效果更佳。第五,分析探討了核酸適配體LA27的抗炎性能及其與LPS的結(jié)合位點(diǎn)和作用模式。以四種脂多糖分別誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞使其產(chǎn)生炎癥因子,利用ELISA法檢測(cè)了空白組、LPS誘導(dǎo)組、LA27抑制組中TNF-?,IL-1?和IL-6等三種炎癥因子的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LA27抑制組中由鼠傷寒沙門氏菌脂多糖、銅綠假單胞菌脂多糖和大腸桿菌脂多糖三種脂多糖分別刺激的細(xì)胞中TNF-?,IL-1?和IL-6炎癥因子的表達(dá)水平顯著降低(p0.01),而腸炎沙門氏菌脂多糖中表達(dá)的炎癥因子水平無(wú)顯著性差異(p0.01)。這說(shuō)明LA27具有一定的抗炎效果,且進(jìn)一步驗(yàn)證了其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌脂多糖、銅綠假單胞菌脂多糖和大腸桿菌脂多糖的識(shí)別能力。利用MOE2018軟件模擬分析發(fā)現(xiàn),在疏水作用、氫鍵作用以及靜電作用三種力的共同作用下,LPS可能通過(guò)類脂A上的脂肪酸鏈與由LA27上T3、T4、T6、T16、T17、T19、T20等7個(gè)胸腺嘧啶T堿基形成的疏水性大溝區(qū)域結(jié)合,形成了穩(wěn)定的類似“T”型結(jié)構(gòu)的復(fù)合物,從而特異性識(shí)別。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;O657.3
【圖文】：

及污水處理廠、實(shí)驗(yàn)室等場(chǎng)所工作的人群，他們可能長(zhǎng)期暴露于脂多糖污受到脂多糖侵害的幾率更大。另外脂多糖又是抗菌藥物的主要作用標(biāo)靶[5,6]靈敏快速、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的脂多糖檢測(cè)方法和篩選脂多糖生物活性加強(qiáng)脂多糖的檢測(cè)和控制以及對(duì)保障人們的身體健康和生命安全具有重要和價(jià)值，而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的核酸適配體技術(shù)為脂多糖的檢測(cè)和拮抗開辟多糖多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)糖是脂質(zhì)和多糖構(gòu)成的化合物，其化學(xué)組成比較復(fù)雜，一般可以將其分為類脂 A（Lipid A）、核心多糖和 O 特異側(cè)鏈重復(fù)單元（圖 1-1），其中類脂 毒性中心[5]。不同細(xì)菌來(lái)源的脂多糖雖然其化學(xué)結(jié)構(gòu)在 O 特異側(cè)鏈重復(fù)單，但其核心多糖和類脂 A 部分則基本相似，結(jié)構(gòu)相對(duì)保守。大多數(shù)革蘭氏多糖都由庚糖、半乳糖、3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸（3-deoxy-D-manno-octulosdo）組成，類脂 A 則由一定數(shù)量的脂肪酸鏈和磷酸基團(tuán)構(gòu)成。

圖 1-2 SELEX 篩選技術(shù)基本原理圖[56]Fig. 1-2 Schematic diagram of the SELEX technology[56]的多樣性，通過(guò)傳統(tǒng)的 SELEX 技術(shù)篩選獲得的核酸適配體，有時(shí)候往往不理想，而且存在篩選耗時(shí)長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)作者們開發(fā)了很多新的篩選技術(shù)，如磁分離 SELEX 篩選技-SELEX 篩選技術(shù)（Graphene Oxide-SELEX）[57]、CE-SELlectrophoresis SELEX）、ePCR-SELEX 篩選技術(shù)（Emulsion PC

圖 1-3 Capture-SELEX 技術(shù)篩選 Cd2+基本原理圖[67]ig. 1-3 Schematic diagram of the Capture-SELEX for selection of cadmium-binding apt種固定文庫(kù)的篩選技術(shù)主要適用于金屬離子、抗生素等小分子或無(wú)固定。相對(duì)于固定靶標(biāo)分子的篩選技術(shù)，固定文庫(kù)的篩選技術(shù)不需要修飾或分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此保證了靶標(biāo)分子的完整性，使篩選獲得的核酸適標(biāo)分子具有高度的親和性和特異性。另外在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中，待測(cè)樣品天然結(jié)構(gòu)且無(wú)法固定的，這樣就避免了固定靶標(biāo)分子的篩選技術(shù)所產(chǎn)生定文庫(kù)的篩選技術(shù)也有其不足，即在固定文庫(kù)的過(guò)程中或多或少地降低序列的多樣性，這有可能導(dǎo)致起始固定文庫(kù)中高親和力、高特異性的核。另外通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式固定的文庫(kù)可能存在著動(dòng)態(tài)的解離平衡過(guò)的難度。非固定靶標(biāo)或文庫(kù)的篩選技術(shù)面提到 SELEX 篩選技術(shù)主要包括孵育結(jié)合、洗脫分離、PCR 擴(kuò)增、單驟。實(shí)踐證明洗脫分離是 SELEX 篩選技術(shù)成功與否最為關(guān)鍵的一步，也

【參考文獻(xiàn)】

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2 王嘉榕;李燕;孫紅賓;;脂多糖——針對(duì)革蘭陰性菌的藥物靶標(biāo)[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2015年04期

3 王小元;宋鴻軍;;細(xì)菌內(nèi)毒素的生物合成途徑及分子結(jié)構(gòu)多樣性[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2013年10期

4 王紅芳;王捧英;施靖;王明霞;;細(xì)菌內(nèi)毒素的臨床生物學(xué)作用及其拮抗劑研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)藥;2013年05期

5 吳仙丹;張近波;張小樂(lè);許國(guó)斌;董美平;朱金強(qiáng);史朝紅;鄢來(lái)超;曹烈祥;董志兵;王文龍;;活化蛋白C通過(guò)NF-κB抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[J];中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志;2012年07期

6 李顏顏;史鋒;李燁;王小元;;細(xì)菌類脂A結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)報(bào);2008年06期

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本文編號(hào)：2752723