【摘要】：自噬是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生功能障礙的組分進(jìn)行自我降解的一種過程,在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程中起著重要作用。p62/SQSTM1蛋白作為一種接頭蛋白可以調(diào)控自噬的發(fā)生,同時也可以被自噬途徑降解。此外,p62蛋白還可以通過與不同蛋白相互作用來調(diào)控不同的信號通路,深入開展p62蛋白的功能研究對于探索細(xì)胞自噬過程以及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要意義。在本研究中,我們對p62蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析;使用mTORC1的特異性抑制劑Rapamycin處理小鼠巨噬細(xì)胞,觀察mTORC1信號通路對p62基因表達(dá)的調(diào)控作用;構(gòu)建mTORC2特有組成成分Rictor的靶向shRNA表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞,觀察mTORC2信號通路對p62表達(dá)的影響;小鼠巨噬細(xì)胞中過表達(dá)p62基因,Western blot檢測mTORC1和mTORC2信號通路活性變化;利用免疫共沉淀技術(shù)獲得可以與p62蛋白相互作用的靶蛋白,對這些蛋白進(jìn)行質(zhì)譜測序及Western blot驗證;使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬,并通過觀察自噬小體形成及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3水平的變化,確定p62在LPS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程中的作用;同時,分析與p62蛋白相互作用的靶蛋白,研究這些靶蛋白對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果表明:1)用綠色熒光標(biāo)記的p62蛋白可以與紅色熒光標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)生重合,p62可以定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體;2)質(zhì)譜檢測和免疫共沉淀結(jié)果表明,p62蛋白、Vps34及FKBP38蛋白相互作用,蛋白相互作用網(wǎng)路分析顯示Rictor與p62、FKBP38具有相互作用關(guān)系,預(yù)示mTORC2可能與p62相關(guān)聯(lián);3)當(dāng)mTORC1和mTORC2的活性受到抑制時,p62基因表達(dá)顯著降低(p0.05);在小鼠巨噬細(xì)胞中過表達(dá)p62基因,提高mTORC1和mTORC2通路活性,反之轉(zhuǎn)錄后沉默p62基因則降低mTORC1和mTORC2通路活性;mTORC1和mTORC2通路與p62間存在反饋調(diào)節(jié)機制4)在LPS引起的細(xì)胞自噬過程中,過表達(dá)p62時自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3水平升高,而轉(zhuǎn)錄后沉默p62,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3水平降低;5)在LPS引起的細(xì)胞自噬中,過表達(dá)Vps34,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3水平升高。總之,通過上述實驗我們發(fā)現(xiàn)p62蛋白可以定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,這是除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之外,p62在內(nèi)膜系統(tǒng)的新定位;mTORC1和mTORC2信號通路調(diào)控p62的表達(dá),同時p62對mTORC1和mTORC2信號通路的活性具有正向調(diào)控作用,存在反饋調(diào)節(jié)機制;相互作用組分析顯示有188種蛋白可能與p62具有直接或間接的相互作用關(guān)系;p62促進(jìn)由LPS引起的細(xì)胞自噬,其相互作用蛋白Vps34亦具有促進(jìn)作用。本文對p62蛋白的亞細(xì)胞定位,與mTORC1/2信號通路之間的相互調(diào)控關(guān)系和p62及其相互作用蛋白在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用的研究結(jié)果,加深了對p62蛋白特性的了解,為進(jìn)一步研究p62蛋白在LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中發(fā)揮的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q25
【圖文】：

抵御毒性或蛋白酶毒性的應(yīng)激反應(yīng)的作用，也被認(rèn)為是保護(hù)性自噬。細(xì)胞內(nèi)、外的誘導(dǎo)自噬發(fā)生，這些信號包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或營養(yǎng)匱乏等。另外，自噬可胞內(nèi)的病原體，在維持細(xì)胞存活方面具有重要意義。自噬的許多關(guān)鍵性功能決定了疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有著不可替代的作用，例如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、糖尿病和[2]。自噬的過程蛋白質(zhì)降解途徑有兩種，泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑。自噬溶酶體系統(tǒng)是膜生物發(fā)生和囊泡轉(zhuǎn)運的蛋白降解途徑，與泛素蛋白酶體系統(tǒng)明顯不同。自噬的第膜囊的出現(xiàn)，然后是膜囊的伸長[3]；被拉長的膜，稱為隔離膜/吞噬泡（isobrane/phagophore），可以吞噬部分細(xì)胞質(zhì)成分，通過膜的兩端融合形成雙膜結(jié)構(gòu)，體；自噬體的外膜隨后與溶酶體膜融合，自噬體的內(nèi)囊泡及其內(nèi)容物被各種溶酶體解[4]（圖 1.1）。

2 蛋白的功能QSTM1/p62 是一種多功能泛素化結(jié)合的接頭蛋白，參與泛素蛋白酶體系統(tǒng)和自兩種蛋白質(zhì)降解過程，同時具有質(zhì)核穿梭功能，在 DNA 損傷修復(fù)和氧化應(yīng)激要作用。p62 作為細(xì)胞接頭蛋白，是細(xì)胞內(nèi)多種蛋白復(fù)合物的主要成分，其分個功能結(jié)構(gòu)域，可通過與其它蛋白質(zhì)的相互作用來調(diào)控不同的信號通路，包括κappa B(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)[15]，核轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2 相關(guān)轉(zhuǎn)ear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)[16]和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mamof rapamycin, mTOR)[17]等信號通路，參與細(xì)胞的生長、自噬、癌變等生理病理過噬過程中的適配蛋白，同時也調(diào)控著自噬的過程。當(dāng)自噬活性減弱時，p62 蛋[18]圖1.2 p62的結(jié)構(gòu)域及相互作用蛋白Figure 1.2 p62 domain and interaction protein

3．p62 與自噬核細(xì)胞內(nèi)高度保守的程序性調(diào)控過程，通常自噬被認(rèn)為年的研究證明自噬是一個選擇性的降解過程，p62 作為發(fā)揮著重要作用。p62 分子的 UBA 結(jié)構(gòu)域上的 Ser407 )磷酸化，隨后 UBA 結(jié)構(gòu)域上的 Ser403 被酪蛋白激酶 2（1（TANK-binding kinase 1）磷酸化導(dǎo)致 p62 泛素化[46]，促進(jìn)以通過自身寡聚化促進(jìn)泛素化底物的包裝，并把包裝的底成過程[47]。LC3 是哺乳動物細(xì)胞中常見的自噬小體標(biāo)記種調(diào)控作用，包括膜融合、自噬物的選擇、自噬小體的運圖 1.3 p62 在 mTORC1 活化的氨基酸信號通路中的作用模型[44] Model for the role of p62 in amino acid signaling towards mTORC1 ac

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本文編號：2752084