【摘要】：瓊膠酶是一類能夠降解瓊膠生成瓊膠寡糖的糖苷水解酶。瓊脂寡糖具有多種生理和生物學(xué)特性,并且在食品、化妝品和醫(yī)療等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。利用瓊膠酶降解瓊膠來制備一系列聚合度不同的瓊膠寡糖,被認(rèn)為是最理想的綠色生產(chǎn)技術(shù)。因此,篩選高效產(chǎn)瓊膠酶的菌株、挖掘酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的瓊膠酶以及制備瓊膠寡糖都具有重要的實(shí)際意義。海洋沉積物中蘊(yùn)藏著非常豐富的微生物資源,本文分別從近海和深海來源的沉積物中挖掘瓊膠酶基因,并建立了以龍須菜為原料制備新瓊二糖的技術(shù),主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)自紅樹林沉積物微生物宏基因組中預(yù)測(cè)到一條編碼氨基酸序列相似性為58.64%的瓊膠酶基因agaM1,并利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行胞外表達(dá)。重組AgaM1(Recombinant AgaM1,rAgaM1)的最適溫度為50°C,最適pH為7.0。rAgaM1具有良好的熱穩(wěn)定性,此外,rAgaM1能夠降解龍須菜,產(chǎn)生新瓊六糖和新瓊四糖;(2)在前期研究中對(duì)分離自西太平洋深海沉積物的新種太平洋火色桿菌Flammeovirga pacifica WPAGA1進(jìn)行了基因組測(cè)序,并對(duì)與瓊脂糖代謝相關(guān)酶的基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。本文主要針對(duì)菌株WPAGA1中唯一的GH50家族的瓊膠酶基因aga2660進(jìn)行深入分析。將瓊膠酶基因aga2660克隆并轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中表達(dá)并純化。結(jié)果表明,重組Aga2660(Recombiant Aga2660,rAga2660)與其他GH50家族的瓊膠酶不同,可以將低聚合度的新瓊寡糖降解為新瓊二糖,但是不能作用于大分子瓊膠的降解。rAga2660最適溫度為30°C,且具有良好的熱穩(wěn)定性,表明該酶在新瓊二糖的工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。(3)以龍須菜為原料,利用rAgaM1和rAga2660聯(lián)合制備新瓊二糖,通過細(xì)胞毒性檢測(cè)和美白功效評(píng)估,結(jié)果表明,與新瓊四、六糖相比,新瓊二糖作用于細(xì)胞上的安全性大大提高,且新瓊二糖的美白功效優(yōu)于新瓊四糖和新瓊六糖,表明rAgaM1和rAga2660聯(lián)用的技術(shù)具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：自然資源部第三海洋研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;O636.1
【圖文】：

6圖 1.1 酶解法降解瓊膠的示意圖[68]Fig.1.1 Schematic diagram of enzymatic hydrolysis of agar[68]酶的分類酶(agarase)是一種能夠降解瓊脂糖和瓊膠的糖苷水解酶，是一種多糖降解酶。瓊膠酶裂解糖苷鍵作用方式的不同，瓊膠酶可分為 α-瓊膠酶和 酶 (EC3.2.1)裂解瓊脂糖的 α-1，3-糖苷鍵，生成以 β-D-半乳糖端 和 以 3 ， 6- 內(nèi) 醚 -α-L- 半 乳 糖 為 還 原 性 末 端 的 瓊

圖 2.2 基于 AgaM1 氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹[113]Fig.2.2 Neighbour-joining tree based on amino acid sequence of agarasesAgaM1[113]2.2.2 瓊膠酶基因 agaM1 的克隆表達(dá)以紅樹林沉積物基因組為模板，根據(jù)瓊膠酶基因 agaM1 的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的基因片段，電泳結(jié)果（圖 2.3 a）顯示，條帶清晰，擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。將重組質(zhì)粒 pHT43-agaM1 轉(zhuǎn)入枯草芽孢感受態(tài) WB800N 細(xì)胞中獲得表達(dá)成功的克隆子。2.2.3 rAgaM1 的 SDS-PAGE 及活性染色結(jié)果重組表達(dá)菌株在起始 OD值為 0.8、IPTG 終濃度為 0.01 mM、30 °C、pH

.3 agaM1 PCR 擴(kuò)增（a）和 rAgaM1 的 SDS-PAGE 及活性染色結(jié)果（：M 為 DNAMarker，1 為 agaM1 擴(kuò)增結(jié)果；b：M 為蛋白 Mark加 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，2 為加 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，3 為活性染色結(jié)果）.2.3（a） PCR ampilification of agaM1 gene；（b）SDS-PAGE analysiactivity staining of rAgaM1gaM1 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果度和 IPTG 濃度對(duì) rAgaM1 表達(dá)的影響0 °C -30 °C（圖 2.4 a-c）條件下，誘導(dǎo)的前 3 h 瓊膠酶活力非常低活力達(dá)到頂峰。在 35 °C（圖 2.4 d）下誘導(dǎo)，前 3 h 瓊膠酶已大量表高，之后酶活力逐漸降低。40 °C 和 50 °C（圖 2.4 e-f）條件下，在瓊膠酶活力達(dá)到最高。

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本文編號(hào)：2751658