【摘要】：隨著人類生活節(jié)奏的加快,血栓性疾病成為了一種常見病、高危病。溶栓藥物的需求量也在增加。相關(guān)研究人員在微生物源纖溶酶的多方面進(jìn)行了研究,例如優(yōu)化各種產(chǎn)酶條件,用基因工程方法改造纖溶酶基因,用一些物理與化學(xué)的方法誘變產(chǎn)纖溶酶菌株等等。本研究主要是對(duì)產(chǎn)纖溶酶菌株的篩選與鑒定,再通過基因工程的手段,使纖溶酶基因在大腸桿菌表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)分泌性的表達(dá)。本研究取得了以下的成果:1、以貴州大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從酒曲、酒糟、窖泥等樣品中分離的13株菌作為出發(fā)菌株,這13株菌能夠產(chǎn)醬香味和芽孢。通過脫脂奶粉平板對(duì)13株菌株進(jìn)行初篩,獲得6株產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)的菌株;再利用纖維蛋白雙層平板對(duì)6株菌進(jìn)行復(fù)篩,獲得一株纖溶酶活力為2344.23IU/mL的菌株,此菌株為GZHZ_(V-8)。2、參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(沈萍等,1999)第三版、《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(David R.Boone等,2001)第九版和《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(東秀珠,2001)對(duì)GZHZ_(V-8)菌株進(jìn)行形態(tài)特征與生理生化鑒定,并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定方法,將此菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。3、在數(shù)據(jù)庫查找纖溶酶基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增纖溶酶基因編碼區(qū)的特異性引物,擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T克隆質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后,連接、轉(zhuǎn)化到E.coil DH5α,重組質(zhì)粒序列全長為1205bp,ORF區(qū)包含1089bp,編碼363個(gè)氨基酸;在線對(duì)克隆序列分析顯示,克隆的纖溶酶基因序列與來自解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的AprE(aprE)基因(NCBI登錄號(hào)GU825966.1),在核酸水平上相似度為99.65%,氨基酸水平上相似度為100%;經(jīng)過相關(guān)的生物信息學(xué)在線網(wǎng)站預(yù)測分析,是一種穩(wěn)定的、親水性的分泌型蛋白。不存在顯著的跨膜區(qū),包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。蛋白分子量為36.99kDa,理論等電點(diǎn)(PI)為8.73,對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲占比36.64%,α螺旋占比28.37%,延伸鏈占比23.69%和β轉(zhuǎn)角占比為11.29%。三維結(jié)構(gòu)模型與模板3whi.1.A相似度為86.36%,具有DNA的結(jié)合區(qū)。4、使用限制性內(nèi)切酶酶切目的DNA與表達(dá)空質(zhì)粒,用T4 DNA Ligase enzyme連接,轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,得到含有纖溶酶基因的表達(dá)菌株,表達(dá)菌株用1mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后測定纖溶酶活性,測得發(fā)酵上清液、菌體細(xì)胞破碎上清液和菌體細(xì)胞破碎沉淀的纖溶酶活力分別為613.26IU/mL、407.38IU/mL、993.12IU/mL。表達(dá)菌株在1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)7小時(shí)后,表達(dá)量較高。發(fā)酵上清液具有溶解血栓的作用。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;Q93
【圖文】：

注：D/d 即為初篩培養(yǎng)基上水解圈直徑（D）/菌落直徑（d），表示菌株產(chǎn)蛋白酶能力的大小3.1.2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3.1 The standard curve of urokinase concentration

尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，繪制尿激酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線x-0.2265，R2為0.9976，具有良好的線性關(guān)系（圖3.1）。纖溶酶菌株的復(fù)篩維蛋白雙層平板進(jìn)行復(fù)篩，將初篩菌株（GZJSⅠ-12-2、GZJ2-7、GZJSⅡ-1、GZHZⅤ-8）發(fā)酵培養(yǎng) 96h 后，在 4℃、8000白雙層平板檢測 6 株菌發(fā)酵上清液的纖溶酶活力，產(chǎn)生明顯的纖溶酶活性的測定方法，首先測量各個(gè)菌株溶解圈垂直均值，計(jì)算出每個(gè)溶解圈的面積，再根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲活力（表 3.2），從表 3.2 可知，GZHZV-8菌株纖溶酶活4.23IU/mL，因此，選擇 GZHZV-8菌株作為產(chǎn)纖溶酶的出

征觀察菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上 30℃恒溫培養(yǎng) 24h 厚，菌落表面光滑且會(huì)反光，濕潤、粘稠度高、極不易凹陷、四周隆起、邊緣乳白色、褶皺呈不規(guī)則鋸齒狀（菌株的鑒定

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本文編號(hào)：2748336