【摘要】：產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)具有抗逆性強(qiáng)、糖代謝迅速、目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn),特別是在500 g·L~(-1)的高葡萄糖濃度下仍可維持很好的發(fā)酵性能,是一株可應(yīng)用于節(jié)能環(huán)保濃醪發(fā)酵的滲透壓工業(yè)酵母。酵母細(xì)胞質(zhì)膜是其與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)能量交換和信號(hào)傳遞的重要場所,在脅迫壓力下會(huì)發(fā)生一系列的動(dòng)態(tài)應(yīng)答,與此相關(guān)的理論機(jī)制可為指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)提供重要的科學(xué)依據(jù)。本研究在建立了一種適合C.glycerinogenes質(zhì)膜提取方法的基礎(chǔ)上,對(duì)其高糖脅迫下質(zhì)膜的組成和相關(guān)基因的全局轉(zhuǎn)錄應(yīng)答機(jī)制展開研究,主要結(jié)果如下:(1)采用先制備原生質(zhì)體、再低滲裂解獲得粗膜提取物、最后雙水相分離純化細(xì)胞質(zhì)膜的策略,優(yōu)化了原生質(zhì)體的制備方法和粗膜的兩相分離純化體系,得到一種適合于C.glycerinogenes的高效質(zhì)膜提取方法,優(yōu)化后質(zhì)膜純度平均可達(dá)65%以上。(2)研究發(fā)現(xiàn),C.glycerinogenes在高濃度葡萄糖脅迫下,細(xì)胞質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸(特別是油酸)和麥角固醇的相對(duì)含量顯著增加,而細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性和通透性出現(xiàn)不同程度的降低。因此,C.glycerinogenes細(xì)胞質(zhì)膜在高糖脅迫下通過增加油酸的含量來穩(wěn)固細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性,通過增加麥角固醇的含量來維持質(zhì)膜穩(wěn)態(tài)。(3)利用RNA-Seq測序技術(shù)考察高糖脅迫下C.glycerinogenes細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)基因的全局轉(zhuǎn)錄應(yīng)答情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):獲得了85個(gè)質(zhì)膜相關(guān)差異顯著表達(dá)基因,其中68個(gè)上調(diào),17個(gè)下調(diào);麥角固醇合成相關(guān)基因ERG6、ERG2、ERG3、ERG5、ERG4顯著上調(diào),這與麥角固醇含量增加的結(jié)果相符合;不飽和脂肪酸合成途徑中大部分基因顯著上調(diào);1個(gè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的差異表達(dá)倍數(shù)最高(log2=9.55);糖脂合成、MAPK途徑、mTOR途徑的差異基因均顯著上調(diào)。此外,受HOG途徑調(diào)控的甘油合成關(guān)鍵基因GPD1沒有上調(diào),而模式菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在高糖脅迫下更多依賴于胞內(nèi)甘油的合成。綜上說明C.glycerinogenes在高糖脅迫下更多依賴于細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞生長相關(guān)基因的調(diào)控應(yīng)答。(4)在RNA-Seq測序結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用RT-qPCR、基因過表達(dá)、異源表達(dá)和重組菌株的高糖耐受性測試等方法挖掘了6個(gè)高糖抗逆性能較好的C.glycerinogenes細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)基因。它們分別是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cg2615(A0A1V2LT11)和Cg5001(A0A2U9R987)、推定的細(xì)胞色素P450基因Cg4756(A9YUC7)、被編碼具有C-5甾醇去飽和酶活性的Cg3824(A0A099P0V3)、編碼具有甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的Cg2914(A0A099P2M9)和推定的尿素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cg2071(A0A1Z8JUV2)。這6個(gè)基因均可提高S.cerevisiae的高糖耐受性,為工程菌株的改造提供了基因來源。
【學(xué)位授予單位】：陜西理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q933
【圖文】：

陜西理工大學(xué)碩士學(xué)位論文主要包括高滲透壓甘油（HOG，High Osmolarity G糖、甘油等相容性物質(zhì)的合成、功能基因的抗逆機(jī)介導(dǎo)的高糖抗逆（HOG）應(yīng)答途徑作為細(xì)胞響應(yīng)外部壓力的關(guān)鍵途中起著主要作用[30,31]，是真核生物進(jìn)化非常保守的isiae 為例，其 HOG 途徑主要通過質(zhì)膜中的滲透壓感 Hkr1 與其它組分的組合作用[35]來激活下游組分來蛋白磷酸化并短時(shí)間內(nèi)易位至細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子Skn7p、Sko1p、Msn2p 和 Msn4p 等，從而調(diào)控大規(guī)糖（高滲）脅迫的全局調(diào)控[36-38]，其作用機(jī)制的示意

4摘自 Wikimedia（作者：Lad圖 1-2 細(xì)胞質(zhì)膜組成的示意圖Fig.1-2 Schematic diagram of plasma membrane compositio外界脅迫的信號(hào)途徑，大多信號(hào)傳導(dǎo)途徑的膜受體在細(xì)胞質(zhì)膜中分布，參與

陜西理工大學(xué)碩士學(xué)位論文加 Lyticase 而不添加 Snailas 時(shí)，C. glycerin達(dá)到 85%以上；固定 Lyticase 添加量為 50 增加不顯著（P>0.05），因此選擇Snailas的最50 mg，逐漸增加 Lyticase 的添加量，原生格較為昂貴的Lyticase用量，選擇Lyticase的Lyticase 的最佳配比為 Snailas 50 mg、Ly體得率可達(dá) 89.55 1.08%。

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本文編號(hào)：2748656