發(fā)布時間：2020-07-09 20:29

【摘要】：Shh信號在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用,它是脊椎動物牙齒發(fā)育的標記物,調(diào)控口腔上皮-間充質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導,同時促進早期牙胚的形態(tài)發(fā)生,并影響牙胚的細胞周期調(diào)控和分化,但Shh信號在牙釉質(zhì)發(fā)育早期調(diào)控機制目前還不清楚。我們通過原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)Shh信號及其通路分子在剛出生小鼠的成釉質(zhì)細胞中均有表達,但隨著成釉質(zhì)細胞進入分泌期,其表達逐漸降低并消失,表明Shh信號可能在分泌前的成釉質(zhì)細胞中有作用。為了準確定義Shh信號在釉質(zhì)發(fā)生過程中的功能,我們構(gòu)建了由成釉質(zhì)細胞特異的Amelx基因啟動子驅(qū)動的、可誘導表達的Amelx-ERCreER小鼠,我們利用該小鼠在分泌前期的成釉質(zhì)細胞中敲除Shh或Smo基因,都發(fā)現(xiàn)了釉質(zhì)發(fā)育不全的表型。據(jù)此,我們推測Shh信號可能參與釉基質(zhì)蛋白的合成或分泌。通過原位雜交和Q-PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在分泌前的成釉質(zhì)細胞中敲除Shh基因會導致釉基質(zhì)蛋白Amelogenin(Amelx),Ameloblastin(Ambn)和Enamelin(Enam)基因表達顯著下調(diào),而且免疫熒光及Western blot實驗都發(fā)現(xiàn)了釉基質(zhì)蛋白顯著減少,我們又通過體外器官培養(yǎng),利用Shh重組蛋白激活Shh信號通路,Q-PCR實驗結(jié)果顯示Amelx,Ambn,Enam基因表達上調(diào),以上結(jié)果表明Shh信號可能直接參與釉基質(zhì)蛋白基因表達調(diào)控。為了驗證我們的推測,我們利用成釉質(zhì)細胞系A(chǔ)LC細胞,以及P2天野生型小鼠的磨牙上皮進行了ChIP分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1,Gli2,Gli3與Amelx,Ambn,Enam的啟動子區(qū)域均有直接結(jié)合,其中Gli2的結(jié)合能力最強。為了確定Gli蛋白與Enam啟動子的結(jié)合區(qū)域是否與我們預測的一致,我們又進行了Luciferase實驗,結(jié)果顯示,Gli與Enam啟動子結(jié)合區(qū)域位于-600bp~-1200bp。以上結(jié)果表明Shh信號主要是通過Gli直接調(diào)控釉基質(zhì)蛋白基因的表達來參與釉質(zhì)發(fā)生。
【學位授予單位】：杭州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q344
【圖文】：

1.2.2 Shh 信號對牙胚的形狀影響小鼠牙胚發(fā)育到牙板期后， Shh 信號開始表達，而在帽狀期，當初級出現(xiàn)時，Shh 的表達增強[19]，同時，Ptch1、Gli1-2 和 Smo 均在牙體上皮和充質(zhì)的重疊區(qū)中表達，但他們均在釉質(zhì)結(jié)外表達，初級和次級釉質(zhì)結(jié)是短號轉(zhuǎn)導中心，表達多種信號分子，包括 Shh、Fgf3、Fgf4、Fgf9、Bmp2、Bmp7、Wnt10a 和 Wn10b[20-23]，并確定牙齒形狀[24-27]。在小鼠胚胎期 E14.Cre; Shh 條件性敲除 Shh，磨牙持續(xù)生長，但是形態(tài)被嚴重破壞，在這一突變小鼠磨牙比野生型小 25%左右，而且形態(tài)有所改變，不能達到正常的然而，F(xiàn)gf4、Bmp2 和 Wnt10b 都在這些牙齒的釉質(zhì)結(jié)中表達，而 Wnt10b在近舌側(cè)有表達，這表明 Shh 的缺失導致細胞命運部分改變，即從舌側(cè)增圖 1.2.1 Shh 信號通路圖。圖 A 通路靜息狀態(tài)下的信號轉(zhuǎn)導，圖 B 通路激活狀態(tài)下的信號轉(zhuǎn)導

Shh 在小鼠磨牙成釉質(zhì)細胞中時空表達為了研究 Shh 信號對牙釉質(zhì)相關(guān)基因的關(guān)系，我們首先利用冰凍切片觀察了 Amelx，Shh 在 B6 小鼠 P0，P2，P4 天磨牙的表達情況，Amelx 0 天 B6 小鼠磨牙成釉質(zhì)細胞中表達，這一時期 Amelx 在近舌側(cè)牙尖處表達(圖 4.1 A)，在小鼠 P2 天，在磨牙牙冠區(qū)成釉質(zhì)細胞中，Amelx 表調(diào)(圖 4.1 B)，小鼠 P4 天，在磨牙牙冠區(qū)成釉質(zhì)細胞中，Amelx 表達明 4.1 C)，而 Shh 在 P0 天小鼠磨牙牙冠區(qū)的成釉質(zhì)細胞中表達，而牙根(圖 4.1 E)；Shh 在 P2 天小鼠磨牙牙冠區(qū)的成釉質(zhì)細胞中表達，而在牙細胞中表達下調(diào)(圖 4.1F)，Shh 在 P4 天小鼠磨牙成釉質(zhì)細胞中表達,牙達(圖 4.1G)。從原位雜交結(jié)果圖我們可以看到 Amelx， Shh 的表達區(qū)域說明 Shh 信號參與了釉質(zhì)發(fā)生過程，但隨著釉質(zhì)發(fā)生的進行，表達逐

學碩士學位論文 合到含有 Neo 和 DTA 篩選基因的打靶載體內(nèi)，其中 Frt-Neo-的中間。同時用從 Addgene 購買的含有 ERT2-Cre-ERT2表達框增 5’端帶有 Kozak 序列的 ERT2-Cre-ERT2-pA 片段，然后將該’同源臂下游的多克隆位點，并保證 Amelx 基因啟動子可以啟動2的表達。將構(gòu)建好的載體，經(jīng)鑒定正確后送去測序（圖 4.2.備中抽，酶切，純化。然后胚胎干細胞基因打靶（圖 4.2.2）培養(yǎng)，囊胚注射，胚胎移植，得到嵌合體小鼠，與 B6 小鼠交鑒定，含有目的基因片段的雜合子小鼠為構(gòu)建成功的 Amelx-。

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本文編號：2747941