【摘要】：Shh信號(hào)在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用,它是脊椎動(dòng)物牙齒發(fā)育的標(biāo)記物,調(diào)控口腔上皮-間充質(zhì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),同時(shí)促進(jìn)早期牙胚的形態(tài)發(fā)生,并影響牙胚的細(xì)胞周期調(diào)控和分化,但Shh信號(hào)在牙釉質(zhì)發(fā)育早期調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。我們通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)及其通路分子在剛出生小鼠的成釉質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),但隨著成釉質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入分泌期,其表達(dá)逐漸降低并消失,表明Shh信號(hào)可能在分泌前的成釉質(zhì)細(xì)胞中有作用。為了準(zhǔn)確定義Shh信號(hào)在釉質(zhì)發(fā)生過(guò)程中的功能,我們構(gòu)建了由成釉質(zhì)細(xì)胞特異的Amelx基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、可誘導(dǎo)表達(dá)的Amelx-ERCreER小鼠,我們利用該小鼠在分泌前期的成釉質(zhì)細(xì)胞中敲除Shh或Smo基因,都發(fā)現(xiàn)了釉質(zhì)發(fā)育不全的表型。據(jù)此,我們推測(cè)Shh信號(hào)可能參與釉基質(zhì)蛋白的合成或分泌。通過(guò)原位雜交和Q-PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),在分泌前的成釉質(zhì)細(xì)胞中敲除Shh基因會(huì)導(dǎo)致釉基質(zhì)蛋白Amelogenin(Amelx),Ameloblastin(Ambn)和Enamelin(Enam)基因表達(dá)顯著下調(diào),而且免疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)了釉基質(zhì)蛋白顯著減少,我們又通過(guò)體外器官培養(yǎng),利用Shh重組蛋白激活Shh信號(hào)通路,Q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Amelx,Ambn,Enam基因表達(dá)上調(diào),以上結(jié)果表明Shh信號(hào)可能直接參與釉基質(zhì)蛋白基因表達(dá)調(diào)控。為了驗(yàn)證我們的推測(cè),我們利用成釉質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)LC細(xì)胞,以及P2天野生型小鼠的磨牙上皮進(jìn)行了ChIP分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli1,Gli2,Gli3與Amelx,Ambn,Enam的啟動(dòng)子區(qū)域均有直接結(jié)合,其中Gli2的結(jié)合能力最強(qiáng)。為了確定Gli蛋白與Enam啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域是否與我們預(yù)測(cè)的一致,我們又進(jìn)行了Luciferase實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,Gli與Enam啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域位于-600bp~-1200bp。以上結(jié)果表明Shh信號(hào)主要是通過(guò)Gli直接調(diào)控釉基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)來(lái)參與釉質(zhì)發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：杭州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q344
【圖文】：

1.2.2 Shh 信號(hào)對(duì)牙胚的形狀影響小鼠牙胚發(fā)育到牙板期后， Shh 信號(hào)開(kāi)始表達(dá)，而在帽狀期，當(dāng)初級(jí)出現(xiàn)時(shí)，Shh 的表達(dá)增強(qiáng)[19]，同時(shí)，Ptch1、Gli1-2 和 Smo 均在牙體上皮和充質(zhì)的重疊區(qū)中表達(dá)，但他們均在釉質(zhì)結(jié)外表達(dá)，初級(jí)和次級(jí)釉質(zhì)結(jié)是短號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，表達(dá)多種信號(hào)分子，包括 Shh、Fgf3、Fgf4、Fgf9、Bmp2、Bmp7、Wnt10a 和 Wn10b[20-23]，并確定牙齒形狀[24-27]。在小鼠胚胎期 E14.Cre; Shh 條件性敲除 Shh，磨牙持續(xù)生長(zhǎng)，但是形態(tài)被嚴(yán)重破壞，在這一突變小鼠磨牙比野生型小 25%左右，而且形態(tài)有所改變，不能達(dá)到正常的然而，F(xiàn)gf4、Bmp2 和 Wnt10b 都在這些牙齒的釉質(zhì)結(jié)中表達(dá)，而 Wnt10b在近舌側(cè)有表達(dá)，這表明 Shh 的缺失導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)部分改變，即從舌側(cè)增圖 1.2.1 Shh 信號(hào)通路圖。圖 A 通路靜息狀態(tài)下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，圖 B 通路激活狀態(tài)下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

Shh 在小鼠磨牙成釉質(zhì)細(xì)胞中時(shí)空表達(dá)為了研究 Shh 信號(hào)對(duì)牙釉質(zhì)相關(guān)基因的關(guān)系，我們首先利用冰凍切片觀察了 Amelx，Shh 在 B6 小鼠 P0，P2，P4 天磨牙的表達(dá)情況，Amelx 0 天 B6 小鼠磨牙成釉質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，這一時(shí)期 Amelx 在近舌側(cè)牙尖處表達(dá)(圖 4.1 A)，在小鼠 P2 天，在磨牙牙冠區(qū)成釉質(zhì)細(xì)胞中，Amelx 表調(diào)(圖 4.1 B)，小鼠 P4 天，在磨牙牙冠區(qū)成釉質(zhì)細(xì)胞中，Amelx 表達(dá)明 4.1 C)，而 Shh 在 P0 天小鼠磨牙牙冠區(qū)的成釉質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而牙根(圖 4.1 E)；Shh 在 P2 天小鼠磨牙牙冠區(qū)的成釉質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而在牙細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)(圖 4.1F)，Shh 在 P4 天小鼠磨牙成釉質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),牙達(dá)(圖 4.1G)。從原位雜交結(jié)果圖我們可以看到 Amelx， Shh 的表達(dá)區(qū)域說(shuō)明 Shh 信號(hào)參與了釉質(zhì)發(fā)生過(guò)程，但隨著釉質(zhì)發(fā)生的進(jìn)行，表達(dá)逐

學(xué)碩士學(xué)位論文 合到含有 Neo 和 DTA 篩選基因的打靶載體內(nèi)，其中 Frt-Neo-的中間。同時(shí)用從 Addgene 購(gòu)買的含有 ERT2-Cre-ERT2表達(dá)框增 5’端帶有 Kozak 序列的 ERT2-Cre-ERT2-pA 片段，然后將該’同源臂下游的多克隆位點(diǎn)，并保證 Amelx 基因啟動(dòng)子可以啟動(dòng)2的表達(dá)。將構(gòu)建好的載體，經(jīng)鑒定正確后送去測(cè)序（圖 4.2.備中抽，酶切，純化。然后胚胎干細(xì)胞基因打靶（圖 4.2.2）培養(yǎng)，囊胚注射，胚胎移植，得到嵌合體小鼠，與 B6 小鼠交鑒定，含有目的基因片段的雜合子小鼠為構(gòu)建成功的 Amelx-。

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本文編號(hào)：2747941