【摘要】：TGA是bZIP家族亞家族中的D族成員,并且TGA轉(zhuǎn)錄因子具有bZIP結(jié)構(gòu)域。其中包括N端堿性結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域可以固定N-X7-R/K-X9與DNA直接結(jié)合,從而決定DNA特異性以及核定位作用。在目前研究中TGA家族N端具有STDXDT磷酸化位點,C端具有谷氨酰胺結(jié)合位點,這些結(jié)合位點共同參與了TGA在不同非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。TGA還具有一個特殊的結(jié)構(gòu)域TGACG,該結(jié)構(gòu)域可以與啟動子as-1結(jié)合從而誘導(dǎo)啟動子的表達。為探索大豆TGA功能,本研究以吉育72號大豆為材料,克隆了GmTGA基因,對其進行生物信息學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄自激活及亞細胞定位等實驗;對苗期大豆根用NaCl,SA,PEG進行非生物脅迫,測定抗逆生理指標和TGA基因表達,確立轉(zhuǎn)GmTGA大豆發(fā)根的脅迫條件后,研究轉(zhuǎn)GmTGA基因大豆發(fā)根在NaCl,SA,PEG等非生物脅迫條件下的功能。本研究為大豆GmTGA在抗逆育種中的應(yīng)用提供候選基因和理論依據(jù),本研究的主要結(jié)果如下所示:1、本研究根據(jù)擬南芥AtTGA1(AT5G65210)和AtTGA4(AT5G10030)蛋白氨基酸序列,在Phytonzome進行Blast獲得大豆相似度較高的TGA基因,并將其命名為GmTGA;利用RT-PCR的方法克隆GmTGA基因,獲得一條1152bp基因序列,其中包括1089bp完整的開放閱讀框,共編碼362個氨基酸;通過在線生物信息軟件進行預(yù)測,預(yù)測結(jié)果表明GmTGA既不是分泌蛋白,也不是親水蛋白。對大豆GmTGA及擬南芥TGA蛋白序列比對分析,發(fā)現(xiàn)均具有bZIP家族的結(jié)構(gòu)域。2、構(gòu)建酵母自激活載體pGBKT7-GmTGA,轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold,在缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp-His獲得陽性轉(zhuǎn)錄子,結(jié)果表明轉(zhuǎn)入GmTGA的酵母菌株在缺陷培養(yǎng)基不生長,證明GmTGA不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。3、構(gòu)建pPSN-GmTGA瞬時表達載體,通過擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化實驗,利用熒光倒置顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)GmTGA轉(zhuǎn)錄因子位于細胞核。4、以苗期大豆根為實驗材料,用不同濃度NaCl,SA,PEG對其進行非生物脅迫,對GmTGA基因表達量、抗氧化酶系統(tǒng)酶的活性及膜質(zhì)過氧化物MDA的含量進行測定,結(jié)果表明GmTGA基因表達量隨著脅迫時間及脅迫濃度增加表現(xiàn)先增高后降低現(xiàn)象;在NaCl脅迫濃度為150mM時,脅迫時間為12h時GmTGA基因表達量最高為4.83;SA脅迫濃度為1.5mM時,脅迫時間為6h時GmTGA基因表達量最高為2.96;PEG脅迫濃度為15%脅迫時間為12h時GmTGA基因表達量最高為7.58。抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)酶的活性隨著脅迫度及脅迫時間均呈現(xiàn)先增高后將低的趨勢,MDA的含量則一直呈現(xiàn)增加的趨勢。5、轉(zhuǎn)GmTGA大豆發(fā)根實驗中,在150mM NaCl、1.5mM SA、15%PEG條件下處理大豆發(fā)根,抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)酶的活性和MDA的含量變化與苗期大豆根各指標變化表現(xiàn)一致;GmTGA基因表達量隨著NaCl、PEG脅迫時間增加表現(xiàn)先升高后降低,在12h達到最大,分別為9.43、10.75;SA則表現(xiàn)為在6h最大為8.28。說明轉(zhuǎn)錄因子GmTGA對非生物脅迫具有一定的響應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2;S565.1
【圖文】：

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章 前 言組為Ⅴ組，主要與花器官發(fā)育有關(guān)。通過對擬南芥研究發(fā)現(xiàn) AtTGAS 除含有堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈外，C 端還具有谷氨酰胺的兩個結(jié)構(gòu)域 Q1 與 Q2，Ⅱ組和Ⅳ組在 N 端還具有 STDXDT 保守的磷酸化位點，如圖 1.2 所示[47-48]SA（水楊酸）是植物信號分子，植物在遭受多種病原體攻擊時，則起到一定的自我保護作用。SA 誘導(dǎo)可以讓植物細胞進行局部死亡，從而讓植物獲得系統(tǒng)的抗性，使得植物對外來菌產(chǎn)生廣譜抗性[49-50]。SA 可以誘導(dǎo)擬南芥 PR(pathogenesis related gene)的大量累積,該基因主要在植物遭受病原體攻擊時發(fā)揮主要作用[51]。研究表明 TGA 轉(zhuǎn)錄因子可以識別 as-1 區(qū)，并與之結(jié)合，而 as-1 屬于啟動子 PR-1 中的順式作用元件,研究發(fā)現(xiàn)NPR1(nonexpressor of pathgenesis related genes 1)作為 SA 的受體可以增強 TGA 與 PR-結(jié)合能力[52]。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn) TGA1-TGA7 均能與 NPR1 發(fā)生互作[53]。

利用 1%瓊脂糖進行電泳檢測，結(jié)果表明（如圖2.1）所示 RNA 提取完好，可以清楚看到 28S，18S，5SrRNA，條帶位置、亮度與理論相符，可以進行后續(xù)實驗。

1arker;1:H20 PCR 產(chǎn)物;2,3,4ker;1:H20 PCR product;2,3,4脂糖電泳檢測 GmTGA 擴增GA amplification products by收，回收產(chǎn)物與克隆載粒的提取。將獲得的質(zhì)粒質(zhì)粒 PCR 電泳結(jié)果表明了與目的基因大小一致的液送往生工生物工程（上.4)可知，已成功克隆出

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1 李紅麗;大豆轉(zhuǎn)錄因子GmTGA基因的克隆及抗逆功能分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

本文編號：2746044