【摘要】：粘質沙雷氏菌生長過程中會產生一種次級代謝產物靈菌紅素。靈菌紅素具有多種的生物活性,能夠抗瘧疾、抗腫瘤、免疫抑制等。野生型粘質沙雷氏菌產生的靈菌紅素產量少,不能滿足工業(yè)化生產的需求。單優(yōu)化培養(yǎng)基也不能使靈菌紅素的產量有很大的提高。隨著生物技術的發(fā)展,通過基因工程研究粘質沙雷氏菌的產靈菌紅素基因,提高靈菌紅素的產量是一條可行的途徑。論文通過平板劃線法從湖水中分離純化得到的一株產色素菌株。用引物27F和1492R對菌株進行16S rDNA擴增。測序結果與NCBI基因庫中比對分析,確定菌株的屬種。然后,采用甲醇提取菌體中色素,將粗提取物進行柱層析分離、純化,獲得較純的紅色色素。采用可見光光度計,傅里葉紅外光譜(FTIR),高效液相色譜與質譜聯(lián)用(LC-MS)分析鑒定紅色色素。論文還研究了靈菌紅素基因克隆及載體的構建。根據(jù)NCBI查找到的菌株同源序列,分別設計了含酶切位點的靈菌紅素合成酶引物和非編碼序列的引物。對靈菌紅素合成關鍵酶基因pigF和pigC進行擴增,并與pBM20-T載體連接,轉化篩選獲得克隆菌株。擴增靈菌紅素基因簇前端的非編碼序列,通過重疊PCR(Overlap PCR)將非編碼序列同克隆基因拼接得到重組基因。將重組基因連接pBM16A-T后,轉入粘質沙雷氏菌中,通過SDS-PAGE分析重組基因表達情況。論文得到以下結果:1.經過多次劃線分離,獲得一株產紅色色素細菌。16S rDNA測序結果顯示菌株與粘質沙雷氏菌具有98%的相似度。使用酸性甲醇提取得到色素粗提取物,經柱層析分離得到純化的紅色色素,確定最佳展開劑為石油醚:乙酸乙酯=4:1。薄層色譜對紅色色素分析,其Rf=0.35。使用可見光光度計掃描400-700 nm波長,圖譜顯示色素的最大吸收峰在535 nm。使用FTIR分析紅色色素,結果表明色素的主要吸收波數(shù)為3436 cm~(-1)、2860 cm~(-1)、2924 cm~(-1)和1628 cm~(-1)。使用LC-MS分析,圖譜顯示主要離子峰為324.5 m/z和325.5 m/z。分析結果與已知靈菌紅素結構特征對比,認定紅色色素為靈菌紅素。據(jù)此,獲得了一株產靈菌紅素的粘質沙雷氏菌。2.用設計的引物分別擴增出合成酶pigF和pigC基因為1200 bp和2700 bp。將pigF和pigC基因擴增產物與pBM20-T載體連接,轉化大腸桿菌DH5α,挑取連接成功的克隆子測序。測序結果與NCBI比對,結果顯示pigF和pigC基因與沙雷氏菌FS14的同源性最高。用引物擴增出非編碼區(qū)的coa-1基因為600 bp。經Overlap PCR,將coa-1基因部分序列與pigC和pigF基因拼接,重組為coa-pic和coa-pif基因。然后分別與pBM16A-T載體連接,轉化大腸桿菌DH5α,挑取連接成功的克隆子測序。測序結果與NCBI比對,結果顯示coa-1與pigC、pigF序列重組成功,構建出pBM16A-coa-pif和pBM16A-coa-pic質粒。3.構建出的質粒轉入粘質沙雷氏菌中篩選出重組子S.m-pif和S.m-pic。用SDS-PAGE分析重組子的蛋白表達,電泳結果顯示重組子都正確表達出蛋白質條帶。通過比對細菌生長中色素吸光度變化,發(fā)現(xiàn)S.m-pif菌株靈菌紅素產量相比野生菌株提高了6.8%而S.m-pic菌株相比野生菌株提高了17.1%。
【學位授予單位】：成都理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q93
【圖文】：

e圖 1-1 五種靈菌紅素。a.靈菌紅素，b.十一烷基靈菌紅素，c.間環(huán)庚基靈菌紅素，d.環(huán)烷基靈菌紅素，e. 間環(huán)靈菌紅素1.3.2 靈菌紅素研究進展

靈菌紅素合成途徑1.3.2.4靈菌紅素分離純化

2.3 實驗結果2.3.1 菌株的分離與鑒定菌株形態(tài)如圖2-1所示。菌株在平板上呈現(xiàn)紅色的圓形菌落。菌落中間凸起，邊緣整齊，中心點呈深紅色，邊緣顏色稍淡，表面圓滑，在光照下有光澤，培養(yǎng)過程中會散發(fā)出惡臭氣味。平板培養(yǎng) 24 小時菌斑直徑即可達約 1mm，延長培養(yǎng)時間可見有紅色色素在瓊脂上擴散。在液體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物為深紅色。經革蘭氏染色劑染色后，在顯微鏡下觀察細菌形態(tài)為桿形，細胞呈現(xiàn)紅色為革蘭氏陰性菌。圖 2-1 粘質沙雷氏菌落2.3.2 16S rDNA 序列分析菌株 16S rDNA 測序結果見附錄 B。將測序結果上傳 NCBI 比對后，結果顯示分離的菌株屬沙雷氏菌屬。在比對結果中隨機選取 20 株菌株構建進化樹如圖2-2（菌種名前面為登錄號）。從圖 2-2 可知，菌株與 serritia mansecens JCM1239等粘質沙雷氏菌種相似度達到 98%。確定挑取到的菌株為粘質沙雷氏菌

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本文編號：2746037