【摘要】：水楊酸(SA)是植物防御的關(guān)鍵信號(hào)因子,可以誘導(dǎo)某些抗病基因的表達(dá),在植物抗病中起重要作用。課題組前期研究證實(shí),SA能夠誘導(dǎo)黃瓜葉片發(fā)生超敏反應(yīng)(HR),是一個(gè)細(xì)胞程序性死亡(PCD)的過程。為進(jìn)一步探究SA的作用機(jī)制,對(duì)SA處理前后的黃瓜葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,得到1756個(gè)差異表達(dá)基因。本研究選擇與線粒體功能相關(guān)的顯著上調(diào)表達(dá)的CsMPC1和CsE1α基因,研究其表達(dá)特性,利用超表達(dá)擬南芥和突變體擬南芥研究基因的功能,為揭示基因在線粒體介導(dǎo)的PCD中的作用奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.用10mM SA和0.2%MeJA分別處理黃瓜葉片,在營(yíng)養(yǎng)器官根、莖、葉和MeJA處理葉片進(jìn)行CsMPC1和CsE1α基因的qRT-PCR表達(dá)分析,并對(duì)根、莖、葉和SA和MeJA處理葉片進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)丙酮酸(PA)含量和丙酮酸脫氫酶(PDH)活性測(cè)定。CsMPC1和CsE1α基因在葉片中具有較高表達(dá)量,在MeJA處理介導(dǎo)PCD過程皆呈上調(diào)表達(dá)調(diào)控;CsMPC1丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因水平改變引起其轉(zhuǎn)運(yùn)PA含量的變化,比較發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān);CsE1α丙酮酸脫氫酶基因水平的改變影響PDH活性的變化,比較發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)。但MeJA和SA處理發(fā)生PCD過程中PDH活性無(wú)明顯變化。2.根據(jù)mRNA開放讀碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,從黃瓜中克隆CsMPC1和CsE1α基因。CsMPC1基因cDNA全長(zhǎng)311bp,蛋白由103個(gè)氨基酸構(gòu)成。CsE1α基因cDNA全長(zhǎng)1199bp,蛋白由399個(gè)氨基酸構(gòu)成。通過NCBI BlastX比對(duì)測(cè)序結(jié)果顯示CsMPC1屬于MPC超家族,CsE1α屬于TPP超家族。3.構(gòu)建CsMPC1和CsE1α基因的超表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到野生型擬南芥植株中,獲得了轉(zhuǎn)CsMPC1和CsE1α基因擬南芥植株。利用三引物法將從擬南芥生物資源中心獲得MPC1基因(SALK_089763.42.10.x)和E1α基因(SALK_056967.56.00.x)T-DNA插入突變體進(jìn)行PCR鑒定獲得純合株系。4.對(duì)篩選出的MPC1和E1α的超表達(dá)擬南芥植株(OE-1和OE#-1)和突變體擬南芥植株(mpc1-1和E1α-1)進(jìn)行表型鑒定、生理指標(biāo)測(cè)定和PCD鑒定。結(jié)果如下:(1)突變體植株mpc1-1對(duì)ABA敏感,具有抗旱的功能;超表達(dá)植株OE-1轉(zhuǎn)運(yùn)PA水平升高,表明PA轉(zhuǎn)運(yùn)體行使功能;突變體植株mpc1-1轉(zhuǎn)運(yùn)PA水平降低,表明PA轉(zhuǎn)運(yùn)受到阻礙,導(dǎo)致線粒體功能下降,糖酵解途徑增強(qiáng),植株生長(zhǎng)受到抑制,但在超表達(dá)和突變體植株中均未檢測(cè)到PCD現(xiàn)象。說明MPC1基因超表達(dá)與敲除時(shí),PA代謝發(fā)生變化但并不影響植物PCD的發(fā)生,這是因?yàn)樵贛PC1基因敲除時(shí)MPC家族其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍在行駛功能,MPC1基因超表達(dá)時(shí)植株正常生長(zhǎng)沒有出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象。(2)超表達(dá)植株OE#-1正常生長(zhǎng),并且PDH活性與WT無(wú)明顯差異,沒有出現(xiàn)細(xì)胞死亡的現(xiàn)象;在突變體植株E1α-1中PDH活性受到抑制,生物體的有氧代謝受到阻礙,嚴(yán)重阻礙細(xì)胞的呼吸,導(dǎo)致ROS大量積累,可能引起植物PCD發(fā)生,從而影響植株正常生長(zhǎng)發(fā)育。這說明E1α基因敲除可能引起植物PCD的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2;S642.2
【圖文】：

2.3 結(jié)果與分析2.3.1 水楊酸、茉莉酸甲酯處理黃瓜葉片的形態(tài)變化如圖 2-1 所示：SA 處理后 3h 葉片出現(xiàn)較明顯黃斑，且僅在 SA 滴加處，沒擴(kuò)散到其它未施加 SA 的區(qū)域。葉片與處理前相比變��；12h 后，葉片上的黃斑得越來(lái)越明顯，數(shù)量增加，面積逐漸擴(kuò)大。較處理前相比葉片邊緣明顯變薄且色變成黃色；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片上黃斑愈發(fā)嚴(yán)重，24h 黃斑面積達(dá)到最較處理前相比葉片邊緣明顯變薄且顏色變成黃色。以上結(jié)果表明，在滴加 SA后 PCD 被激活，葉片上 SA 處理區(qū)域細(xì)胞死亡；且隨時(shí)間推移病斑面積逐漸變擴(kuò)散到未處理區(qū)域，在 24h PCD 程度達(dá)到最大化，大面積葉片細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)MeJA 處理黃瓜葉片 3h 后，未出現(xiàn)較明顯黃斑；隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，至 12MeJA 處理區(qū)域出現(xiàn)大量黃斑，且葉片邊緣變得枯黃，葉片與處理前明顯變得輕24h 病斑面積并未擴(kuò)大，但葉片厚度明顯變薄，葉片從邊緣開始出現(xiàn)干枯現(xiàn)象。上結(jié)果表明，在滴加 MeJA12h 后 PCD 被明顯激活，24h 后葉片細(xì)胞死亡程度達(dá)大化。

圖 2-2 黃瓜根、莖、葉（A）和茉莉酸甲酯（MeJA）（B）處理葉片的總 RNAA： 1：根； 2：莖； 3：葉；B： 1：MeJA 處理 0h； 2：MeJA 處理 3h；3：MeJA 處理 12h； 4：MeJA 處理 24hFig.2-2 Total RNA from the roots, stems and leaves of Cucumis sativus and the leaves ofCucumis sativus treated by MeJAA: 1：roots； 2：stems； 3：leaves；B: 1: MeJA treated leaves for 0h; 2:MeJA treated leaves for 3h;3: MeJA treated leaves for 12h; 4: MeJAtreated leaves for 24h2.3.3 CsMPC1 和 CsE1α基因的 RT-PCR 表達(dá)分析當(dāng)內(nèi)參基因的亮度一致時(shí)，利用半定量 RT-PCR 初步鑒定和分析目的基因表達(dá)水平[72]。如圖 2-3-A 采用 RT-PCR，檢測(cè)到黃瓜營(yíng)養(yǎng)器官根、莖、葉中 CsMPC1 和CsE1α基因表達(dá)水平。CsMPC1 基因在根和葉中均表達(dá)，在莖中未明顯表達(dá)，在葉中具有最高表達(dá)量；CsE1α基因在根、莖、葉三個(gè)組織中均有表達(dá)，但從瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度分析，根莖葉中基因的表達(dá)量均低于內(nèi)參基因 18s。其中，葉片中

-3 黃瓜根莖葉（A）和茉莉酸甲酯（MeJA）（B）處理葉片半定量表達(dá)分g.2-3 The Semi-quantitative expression analysis of in the roots, stems and leaveof cucumber and leaves of Cucumis sativus treated by MeJAPC1 和 CsE1α基因的 qRT-PCR 表達(dá)分析量 RT-PCR 相比，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 更加靈敏，快速，重復(fù)性析表達(dá)水平更具權(quán)威性[73]。圖 2-4 利用 qRT-PCR，檢測(cè)黃瓜根、理葉片 CsMPC1 和 CsE1α基因表達(dá)水平。黃瓜根莖葉 CsMPC1 和，采用 2 CT法分析數(shù)據(jù)，根表達(dá)量設(shè)定為單位 1，并且 CsMP相對(duì)表達(dá)水平是根的兩倍。莖中相對(duì)根部表達(dá)量低，是根部的，莖和葉的表達(dá)量均高于根部，分別約為根部的 2 倍和 8 倍。前期利用 10mM 水楊酸處理黃瓜葉片，CsMPC1 和 CsE1α基因。圖 2-4 MeJA 處理下 CsMPC1 和 CsE1α基因也為上調(diào)表達(dá)調(diào)控， 處理 3h 與對(duì)照 0h 相比上調(diào)幅度較小，至 12h 仍不明顯，處理度升高，大約為 0h 的 8 倍，達(dá)到表達(dá)量高峰值；CsE1α基因 Me24h 持續(xù)穩(wěn)定上升，12h 約為 0h 對(duì)照的 4 倍，24h 達(dá)到處理時(shí)間

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本文編號(hào)：2745056