【摘要】：纖維素是地球上含量最多的可再生性資源,其天然結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在自然環(huán)境下降解緩慢。目前利用纖維素酶對(duì)纖維素資源進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化是人們研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期從Bacillus licheniformis ATCC 14580菌株中克隆了GH12家族酶基因cel12A,并對(duì)其進(jìn)行了初步的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究。本論文以此為基礎(chǔ),一方面對(duì)Cel12A的內(nèi)切纖維素酶功能進(jìn)行研究,通過(guò)序列比對(duì)和突變體構(gòu)建確定了對(duì)酶活性具有重要作用的氨基酸位點(diǎn),并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。另一方面以Cel12A為對(duì)象,利用電子顯微鏡觀察及協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)等探討了小分子量的GH12家族酶可能存在的非水解膨脹功能。本文的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)通過(guò)序列比對(duì)確定了GH12家族纖維素酶中可能與酶功能相關(guān)的15個(gè)保守氨基酸,對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了丙氨酸篩選,突變體酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示這些氨基酸對(duì)Cel12A的活性具有不同程度的影響。親核基團(tuán)E155和酸堿催化基團(tuán)E243突變后,重組酶活性完全喪失;D137突變后重組酶幾乎喪失全部酶活性,暗示D137可能作為“催化三聯(lián)體”的第三個(gè)成員發(fā)揮作用;此外N51A、W53A、Y89A及N133A突變體比酶活失活近80%,M157A與W159A突變體比酶活失活近70%,V86A與W139A突變體比酶活失活近60%,P167A與F245A突變體比酶活失活近30%,V199A和I189A突變體比酶活失活低于20%。(2)進(jìn)一步對(duì)影響酶活性程度較大的N51、W53、Y89和N133四個(gè)位點(diǎn)的功能進(jìn)行研究。對(duì)N51進(jìn)行天冬氨酸D和丙氨酸A方向的突變,突變后酶的剩余活性均不足30%,顯示出N51可能通過(guò)與底物結(jié)合形成氫鍵而發(fā)揮作用。對(duì)W53進(jìn)行酪氨酸Y和組氨酸H方向的突變,突變后酶的剩余活性均不足30%,說(shuō)明W53可能在GH12家族酶分子與底物識(shí)別與結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。對(duì)Y89進(jìn)行苯丙氨酸F方向突變,突變后酶基本維持原來(lái)的活性,推測(cè)在酶催化底物過(guò)程中Y89的作用是維持糖環(huán)正確的構(gòu)象。對(duì)N133進(jìn)行天冬氨酸D、苯丙氨酸F方向的突變,結(jié)果顯示突變體后的酶活性呈梯度下降,表明N133與酸堿催化基團(tuán)之間所形成的氫鍵是Cel12A識(shí)別與催化纖維素類底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),同時(shí),N133突變體最適pH向酸性方向偏轉(zhuǎn)了近0.4個(gè)單位,暗示該位點(diǎn)能夠影響催化殘基的催化環(huán)境,進(jìn)而對(duì)酶活性的維持及催化斷鍵時(shí)的最適pH產(chǎn)生影響。(3)掃描電子顯微鏡觀察到經(jīng)Cel12A預(yù)處理的不溶性纖維素底物明顯變得蓬松;同時(shí)也檢測(cè)到Cel12A與商品化纖維素酶在與這些底物的作用過(guò)程中具有協(xié)同作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cel12A作為小分子量蛋白發(fā)揮了類似于植物ExPansin及Swollenin的膨脹功能。(4)為進(jìn)一步探究Cel12A發(fā)揮膨脹功能的原因,以內(nèi)切纖維素酶活性完全喪失的Cel12A失活突變體為材料進(jìn)行了膨脹實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,Cel12A失活突變體也能一定程度地發(fā)揮膨脹功能,但與野生型相比,膨脹功能有所下降,說(shuō)明Cel12A具有膨脹功能的原因可能與其內(nèi)切纖維素酶的活性及小分子蛋白的特性均具有相關(guān)性。本論文探討了Cel12A的分子作用機(jī)制及非酶因子膨脹功能,為GH12家族纖維素酶的蛋白質(zhì)工程改造及體外高效復(fù)合酶系的構(gòu)建提供了理論和實(shí)驗(yàn)信息。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55
【圖文】：

圖.出.n.切臼

CD圖 0-1 Cel12A 處理濾紙的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 0-1 Scanning electron micrograph of filter paper treated by Cel12A: filter paper treated by Cel12A is enlarged 400 times; B: filter paper treated ffer is enlarged 400 times C: the filter paper treated by Cel12A is enlarged 16times; D: filter paper treated by buffer is enlarged 1600 times)AB

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本文編號(hào)：2739593