發(fā)布時間：2020-06-29 14:49

【摘要】：核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)(Isothermal amplification technology)的反應(yīng)過程始終維持在恒定溫度,不需要精密的溫度控制儀器,在體外核酸檢測方面有獨特的優(yōu)勢,是一種便利的體外核酸快速檢測方法。而環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在60-65℃條件下,通常在一小時內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增,是一種強(qiáng)大的等溫核酸擴(kuò)增方法,反應(yīng)產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀,所以可以通過肉眼觀察來判斷靶基因是否存在。但缺點是在反應(yīng)過程中常發(fā)生非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽性信號。為了提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,本論文分別將LAMP擴(kuò)增與一步鏈置換反應(yīng)(One-step strand displacement,OSD)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)聯(lián)用,并分別借流式細(xì)胞儀、血糖儀等最終實現(xiàn)了諾如病毒基因的多手段靈敏檢測。在磁球協(xié)助的分離純化后,實現(xiàn)了在外加糞便中檢測到了30個拷貝的諾如病毒DNA。具體研究內(nèi)容如下:LAMP與OSD聯(lián)用,借助實時熒光定量PCR儀檢測諾如病毒:普通的DNA染料(Evagreen)沒有特異性識別DNA序列的功能,而OSD探針可對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行特異性識別。因而,通過LAMP-OSD的偶聯(lián),通過優(yōu)化反應(yīng)條件,可以避免假陽性問題。但是,在糞便溶液中檢測諾如病毒或者加入具有干擾性的輪狀病毒LAMP產(chǎn)物時,LAMP-OSD熒光信號易受影響,而不利于信號的檢測。LAMP與HCR聯(lián)用,借助流式細(xì)胞儀檢測諾如病毒:本研究提出了LAMP與HCR聯(lián)用型基因檢測新技術(shù),并對該聯(lián)用技術(shù)的可行性、必要性和技術(shù)優(yōu)勢進(jìn)行了驗證。帶有熒光基團(tuán)的DNA在磁球表面發(fā)生LAMP-HCR擴(kuò)增。將帶有LAMP-HCR產(chǎn)物的磁球應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,最低可檢測到30拷貝的諾如病毒基因。由于磁球的分離純化作用,即使加入不同百分比的糞便樣品(0.1%~2%),檢測效果完全沒有受到影響。LAMP與HCR聯(lián)用,借助血糖儀檢測諾如病毒:帶有蔗糖酶的DNA在上述的磁球表面發(fā)生LAMP-HCR擴(kuò)增,然后將帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的磁球與蔗糖混合,蔗糖酶會水解蔗糖為葡萄糖,進(jìn)而可用血糖儀進(jìn)行檢測。在2%的糞便樣品中,也可檢測到30拷貝的諾如病毒基因,同時還可實現(xiàn)諾如病毒的現(xiàn)場快速診斷。
【學(xué)位授予單位】：長春理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O652;Q52
【圖文】：

圖 1.2 LAMP 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分法時檢測在實時濁度儀的幫助下通過渾濁度，由此得到濁度曲線（圖 1.靶標(biāo)可明顯降低成本。為了觀察到R 擴(kuò)增比 LAMP 擴(kuò)增需要更多的待在 PCR 體系中，由于溫度高于 94磷酸根離子的量很少，不易觀察到種具有應(yīng)用前景的諾如病毒檢測化是檢測基因擴(kuò)增的簡單方法[30]。

圖 1.2 LAMP 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析時渾濁度檢測法P 放大反應(yīng)的實時檢測在實時濁度儀的幫助下通過分光光度法完成每 6 s 記錄一次渾濁度，由此得到濁度曲線（圖 1.3）。與昂貴的實時應(yīng)用濁度儀檢測靶標(biāo)可明顯降低成本。為了觀察到焦磷酸鹽的白色擴(kuò)增體系中，PCR 擴(kuò)增比 LAMP 擴(kuò)增需要更多的待檢測物，因此 P度較低。另外，在 PCR 體系中，由于溫度高于 94 ℃，PCR 過程中解成磷酸鹽，焦磷酸根離子的量很少，不易觀察到白色沉淀的產(chǎn)生渾濁度檢測法是一種具有應(yīng)用前景的諾如病毒檢測手段。因此利用 擴(kuò)增后的濁度變化是檢測基因擴(kuò)增的簡單方法[30]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏東;汪潔英;王國治;;鼠疫耶爾森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2012年09期

本文編號：2733999