【摘要】：核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Isothermal amplification technology)的反應(yīng)過程始終維持在恒定溫度,不需要精密的溫度控制儀器,在體外核酸檢測(cè)方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),是一種便利的體外核酸快速檢測(cè)方法。而環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在60-65℃條件下,通常在一小時(shí)內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增,是一種強(qiáng)大的等溫核酸擴(kuò)增方法,反應(yīng)產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀,所以可以通過肉眼觀察來判斷靶基因是否存在。但缺點(diǎn)是在反應(yīng)過程中常發(fā)生非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽性信號(hào)。為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,本論文分別將LAMP擴(kuò)增與一步鏈置換反應(yīng)(One-step strand displacement,OSD)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)聯(lián)用,并分別借流式細(xì)胞儀、血糖儀等最終實(shí)現(xiàn)了諾如病毒基因的多手段靈敏檢測(cè)。在磁球協(xié)助的分離純化后,實(shí)現(xiàn)了在外加糞便中檢測(cè)到了30個(gè)拷貝的諾如病毒DNA。具體研究?jī)?nèi)容如下:LAMP與OSD聯(lián)用,借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)諾如病毒:普通的DNA染料(Evagreen)沒有特異性識(shí)別DNA序列的功能,而OSD探針可對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行特異性識(shí)別。因而,通過LAMP-OSD的偶聯(lián),通過優(yōu)化反應(yīng)條件,可以避免假陽性問題。但是,在糞便溶液中檢測(cè)諾如病毒或者加入具有干擾性的輪狀病毒LAMP產(chǎn)物時(shí),LAMP-OSD熒光信號(hào)易受影響,而不利于信號(hào)的檢測(cè)。LAMP與HCR聯(lián)用,借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)諾如病毒:本研究提出了LAMP與HCR聯(lián)用型基因檢測(cè)新技術(shù),并對(duì)該聯(lián)用技術(shù)的可行性、必要性和技術(shù)優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了驗(yàn)證。帶有熒光基團(tuán)的DNA在磁球表面發(fā)生LAMP-HCR擴(kuò)增。將帶有LAMP-HCR產(chǎn)物的磁球應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),最低可檢測(cè)到30拷貝的諾如病毒基因。由于磁球的分離純化作用,即使加入不同百分比的糞便樣品(0.1%~2%),檢測(cè)效果完全沒有受到影響。LAMP與HCR聯(lián)用,借助血糖儀檢測(cè)諾如病毒:帶有蔗糖酶的DNA在上述的磁球表面發(fā)生LAMP-HCR擴(kuò)增,然后將帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的磁球與蔗糖混合,蔗糖酶會(huì)水解蔗糖為葡萄糖,進(jìn)而可用血糖儀進(jìn)行檢測(cè)。在2%的糞便樣品中,也可檢測(cè)到30拷貝的諾如病毒基因,同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)諾如病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O652;Q52
【圖文】：

圖 1.2 LAMP 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分法時(shí)檢測(cè)在實(shí)時(shí)濁度儀的幫助下通過渾濁度，由此得到濁度曲線（圖 1.靶標(biāo)可明顯降低成本。為了觀察到R 擴(kuò)增比 LAMP 擴(kuò)增需要更多的待在 PCR 體系中，由于溫度高于 94磷酸根離子的量很少，不易觀察到種具有應(yīng)用前景的諾如病毒檢測(cè)化是檢測(cè)基因擴(kuò)增的簡(jiǎn)單方法[30]。

圖 1.2 LAMP 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)渾濁度檢測(cè)法P 放大反應(yīng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)在實(shí)時(shí)濁度儀的幫助下通過分光光度法完成每 6 s 記錄一次渾濁度，由此得到濁度曲線（圖 1.3）。與昂貴的實(shí)時(shí)應(yīng)用濁度儀檢測(cè)靶標(biāo)可明顯降低成本。為了觀察到焦磷酸鹽的白色擴(kuò)增體系中，PCR 擴(kuò)增比 LAMP 擴(kuò)增需要更多的待檢測(cè)物，因此 P度較低。另外，在 PCR 體系中，由于溫度高于 94 ℃，PCR 過程中解成磷酸鹽，焦磷酸根離子的量很少，不易觀察到白色沉淀的產(chǎn)生渾濁度檢測(cè)法是一種具有應(yīng)用前景的諾如病毒檢測(cè)手段。因此利用 擴(kuò)增后的濁度變化是檢測(cè)基因擴(kuò)增的簡(jiǎn)單方法[30]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 魏東;汪潔英;王國(guó)治;;鼠疫耶爾森氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2012年09期

本文編號(hào)：2733999