【摘要】：乳桿菌表層蛋白作為乳桿菌細(xì)胞壁外的一層特殊結(jié)構(gòu),已被證明具有保護(hù)菌體完整性和益生性質(zhì)的作用。近年來,越來越多的研究開始關(guān)注表層蛋白自身的生物學(xué)功能如抗氧化作用、免疫功能以及抑菌作用等,但其對表層蛋白生物學(xué)功能的作用機(jī)制以及研究范圍仍舊比較有限。本論文從表層蛋白對乳桿菌益生性質(zhì)的影響開始研究,進(jìn)一步探究純化后表層蛋白的黏附、抗炎以及抑菌功能,旨在發(fā)現(xiàn)乳桿菌表層蛋白更多的生物學(xué)功能,為其進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。首先通過提取和電泳鑒定篩選出7株攜帶表層蛋白的乳桿菌,Lactobacillus.acidophilus NCFM、L.acidophilus ATCC 4356、L.acidophilus CGMCC 1.1878、L.fermentum CCFM 421、L.gohnsnil JCM 1101、L.crispatus JCM 2009、L.fermentum CCFM Y40。使用LiCl去除7株乳桿菌的表層蛋白后,菌株自聚率、表面電荷吸附率、與沙門氏菌共聚率相較完整菌株均顯著下降(P0.05)。菌株疏水性除L.acidophilus NCFM外均較完整菌株顯著降低(P0.05),表明表層蛋白的存在對乳桿菌上述表面性質(zhì)有積極作用。模擬胃腸道耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LiCl處理后的菌株在模擬胃腸環(huán)境中的存活率較完整菌株顯著降低(P0.05),表明表層蛋白對胃腸道環(huán)境下的乳桿菌具有保護(hù)作用。乳桿菌黏附HT-29細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在去除表層蛋白之后,7種乳桿菌黏附率較之前均顯著下降,其中L.acidophilus NCFM下降最大,達(dá)到73.6%(P0.05)。純化得到了4株乳桿菌的表層蛋白(L.acidophilus NCFM、L.acidophilus CGMCC1.1878、L.fermentum CCFM 421、L.crispatus 2009),發(fā)現(xiàn)4種表層蛋白在排除、競爭、替換三種處理方式下均可以顯著抑制大腸桿菌和沙門氏菌對HT-29細(xì)胞的黏附(P0.05),但不同方式的作用效果不同。表明表層蛋白可以通過與致病菌競爭黏附位點(diǎn)或掩蓋干擾其識別黏附位點(diǎn)等方式拮抗致病菌對HT-29細(xì)胞的黏附。通過對大腸桿菌感染的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞活力和IL-8分泌的測定,發(fā)現(xiàn)L.acidophilus NCFM表層蛋白能夠抑制大腸桿菌誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞的IL-8的上調(diào),表明表層蛋白具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)的作用,能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL-8促炎癥因子。進(jìn)一步探究表層蛋白對致病菌的抗菌作用,通過生長曲線和活菌計數(shù)證實(shí)L.acidophilus NCFM和L.acidophilus CGMCC 1.1878的表層蛋白具有提高Nisin抑制金黃色葡萄球菌抑菌活性的作用。Nisin單獨(dú)或與表層蛋白聯(lián)合處理時,可以觀察到顯著的膜透性變大以及A_(260nm)吸收物質(zhì)的釋放(P0.05)。此外,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明Nisin與表層蛋白的聯(lián)合抑菌機(jī)理涉及細(xì)胞內(nèi)酶活力的降低,細(xì)胞膜損傷以及細(xì)胞膜電位的降低。未來可能通過二者的聯(lián)合使用,解決Nisin的抗藥性問題。綜上,本論文研究發(fā)現(xiàn)攜帶表層蛋白對菌體表面性質(zhì)、胃腸道耐受性以及黏附功能具有積極作用。純化的表層蛋白能夠拮抗致病菌黏附及調(diào)節(jié)致病菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。此外可與Nisin聯(lián)合使用抑制S.aureus。研究顯示了乳桿菌表層蛋白對菌株益生功能的貢獻(xiàn)及自身抑菌和免疫調(diào)節(jié)方面的潛能,為其進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.3
【圖文】：

圖 3-2 乳桿菌表層蛋白離子層析交換圖譜A-L. acidophilus NCFM；B- L. acidophilus CGMCC 1.1878; C- L. crispatus JCM 2009; D- L. fermentumCCFM 421Fig.3-2 Ion exchange chromatography patterns of surface layer proteins from Lactobacillus strains圖 3-3 純化后乳桿菌表層蛋白 SDS-PAGE

自聚可以使乳桿菌相互累積形成屏障，阻止致病菌的定實(shí)驗(yàn)通過對比 5 mol/L LiCl 處理去除表層蛋白后的菌體與全菌體的自對乳桿菌表面性質(zhì)的影響。7 種乳桿菌的自聚集能力如圖 3-4 所示。自聚集能力存在顯著性差異（P<0.05）。其中，L. crispatus JCM 200聚集能力，高達(dá) 44.89%±1.42，其余菌株自聚率均處于 14%-20%之間酸乳桿菌之間也有差異，L. acidophilus NCFM 以 20.09%的自聚率明顯菌株（P<0.05）。菌體的自聚現(xiàn)象與其益生功能緊密相關(guān)，并與菌體質(zhì)和黏附特性有一定的相關(guān)性，自聚性高的菌株往往更易于定植于消作用[37]。去表層蛋白的處理組自聚率均低于對照組，且差異顯著（P<0.05）tus JCM 2009 下降幅度最大，達(dá)到 54.48%。而同種嗜酸乳桿菌屬的三的變化亦不相同，L. acidophilus NCFM 受到 LiCl 處理的影響最大，61%，而 1.1878 僅下降了 19.43%。說明表層蛋白的存在對乳桿菌的自，且對菌株自聚性質(zhì)的影響程度具有菌株差異性，這種差異也存在于此可以推測，上述菌株的表層蛋白可能對乳桿菌的非特異性黏附有所

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本文編號：2729503