【摘要】：雙生病毒是一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA病毒,廣泛分布于全球50多個國家和地區(qū),對番茄、木薯、棉花等多種草本植物造成毀滅性危害。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,研究者們不斷地從柑橘、葡萄、桑樹和蘋果等多種多年生木本植物中檢測到了新的雙生病毒。由于基因組比較小,編碼的遺傳信息有限,雙生病毒需要依賴與植物復(fù)雜的相互作用才能完成復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和移動等生活史。因此,研究雙生病毒與植物的互作對于了解植物抵御病毒侵染的機(jī)制以及病毒的致病機(jī)理具有重要作用。�；ㄈ~型矮縮相關(guān)病毒(Mulberry mosaic dwarf-associated virus,MMDaV)是從表現(xiàn)花葉和矮縮的桑樹上分離的一種單組份雙生病毒。由于生物學(xué)特性以及致病機(jī)理尚不明確,MMDaV被國際病毒分類委員會劃分為雙生病毒科的一個暫定種。本論文充分利用研究植物與病毒互作的模式植物——本氏煙,對MMDaV與植物的相互作用開展了以下研究:首先構(gòu)建了MMDaV的侵染性克隆并將其接種本氏煙,發(fā)現(xiàn)MMDaV的侵染性克隆接種3天后在本氏煙上引起了類似過敏性反應(yīng)的細(xì)胞死亡。進(jìn)一步將MMDaV病毒鏈上編碼的V1、V2、V3、V4和V5以及互補(bǔ)鏈上編碼的C1(RepA)和C2(Rep)構(gòu)建到含有GFP標(biāo)簽的植物雙元表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)方法浸潤本氏煙,發(fā)現(xiàn)MMDaV編碼的RepA的表達(dá)在本氏煙上誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。為了明確RepA引起細(xì)胞死亡的相關(guān)功能域,利用生物信息學(xué)對RepA的序列和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析,構(gòu)建了RepA的8個缺失突變體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)試驗,發(fā)現(xiàn)RepA的RCA motif是RepA在本氏煙上誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的。進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡對RepA及其突變體的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)RepA定位于本氏煙表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中,并且RepA的細(xì)胞核定位可能與其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有關(guān)。在植物中,MAPK級聯(lián)反應(yīng)和茉莉酸等信號途徑參與了植物對多種病原物的抗性。為了篩選參與RepA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的寄主因子,利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對本氏煙中的NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、WRKY1、NPR1和MEK2等8個基因進(jìn)行沉默,之后在相應(yīng)基因沉默的煙草上瞬時表達(dá)RepA,發(fā)現(xiàn)NDR1、RAR1、COI1、CTR1、NTF6、NPR1和MEK2等7個基因的沉默不影響RepA引起的細(xì)胞死亡的產(chǎn)生,而WRKY1沉默后抑制了RepA引起的細(xì)胞死亡。進(jìn)一步在WRKY1沉默的植物上接種MMDaV的侵染性克隆,發(fā)現(xiàn)WRKY1的沉默也抑制了MMDaV侵染引起的細(xì)胞死亡。利用實時熒光定量PCR分析了RepA以及MMDaV接種后WRKY1的基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)RepA的表達(dá)或者M(jìn)MDaV的侵染均顯著上調(diào)了WRKY1的表達(dá),推測MMDaV的RepA通過激活WRKY1的表達(dá)而引起了細(xì)胞死亡反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S432.41
【圖文】：

2玉米線條病毒屬病毒是一類由葉蟬以持久性方式傳播的單組份雙生病毒�；蚪M是 2.6-2.8kb的單鏈環(huán)狀 DNA 分子，病毒鏈含有 2 個 ORF (V1 和 V2)，分別編碼衣殼蛋白 (Coat protein, CP)和運動蛋白 (Movement protein, MP)；互補(bǔ)鏈含有 2 個 ORF (C1 和 C2)，分別編碼與復(fù)制相關(guān)的蛋白 (Replication associated protein A, RepA 和 Replication associated protein, Rep)。該病毒屬病毒兩條鏈之間還包含兩個大小不同的基因間隔區(qū)，分別為大的基因間隔區(qū) (Large intergenic region,LIR)和小的基因間隔區(qū) (Small intergenic region, SIR)。LIR 中含有雙生病毒復(fù)制所必需的 9 堿基保守序列“TAATATT↓AC”，SIR 中含有轉(zhuǎn)錄的終止信號。玉米線條病毒屬病毒既能侵染單子葉植

為了反抗植物的 PTI 以達(dá)到成功侵染的目的，病原物也進(jìn)化出多種方式，如干擾膜上受體MP 的識別，或者分泌一些效應(yīng)蛋白來改變抗性信號或者抑制其防衛(wèi)反應(yīng) (Dodds and Rath10)。如革蘭氏陰性細(xì)菌通過水平基因轉(zhuǎn)化和對鞭毛器官的適應(yīng)，進(jìn)化出一種 III 型分泌系TSS)，細(xì)菌可以通過 TTSS 將效應(yīng)蛋白傳送到寄主植物的細(xì)胞內(nèi)，從而抑制 PAMP 介導(dǎo)的防應(yīng)。丁香假單胞菌可以分泌 AvrPto、AvrRpt2 和 AvrRpm1 來抑制植物的 PTI。致病疫霉的效 Avr3a 通過與寄主的 CMPG1 E3 連接酶互作來抑制激發(fā)子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (Bos et al., 2010一旦病原物分泌的效應(yīng)蛋白突破了寄主植物第一道防線-PTI，植物又會進(jìn)化出第二道更專的免疫機(jī)制來識別效應(yīng)子，進(jìn)而引發(fā)效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng) (Effector-Triggered Immunity, suda and Katagiri, 2010)。寄主植物分泌抗性蛋白 (R 蛋白)，可以特異性識別細(xì)菌、真菌、卵病毒等病原物的效應(yīng)蛋白，進(jìn)而激活 ETI 反應(yīng)。研究表明，很多 R 蛋白都含有核酸結(jié)合位BS)、富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (LRR)、卷曲螺旋區(qū)域 (CC) 和 Toll-白介素-1 受體 (TIR) 等結(jié)別負(fù)責(zé)對效應(yīng)子的識別和信號轉(zhuǎn)運等，進(jìn)而抵抗病原物的侵染 (Cuietal.,2015)。幾乎每一個基因組都會編碼幾百個 NB-LRRs 負(fù)責(zé) ETI 的激活 (Hofberger et al., 2014)。圖 1.3 植物與病原物的互作模式圖 (Dangl et al., 2013)Fig. 1.3 Model diagram of plant and pathogen interactions

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9 趙s沛

本文編號：2726185