【摘要】：雷公藤甲素(triptolide)被公認為雷公藤(Tripterygium wilordii Hook.f.)中主要活性成分之一,研究表明雷公藤甲素具有明顯的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等重要生物活性,并對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森、老年癡呆癥等)展現(xiàn)出潛在的藥用價值;雷公藤甲素已成為下一個“blockbuster”藥物的先導化合物之一,且多個雷公藤甲素衍生物已進入臨床研究階段。目前活性成分雷公藤甲素主要來源于:(1)化學合成,(2)從雷公藤植株中提取分離;因其結(jié)構(gòu)復雜含多個手性中心,化學合成工藝繁瑣,雷公藤甲素產(chǎn)率較低,且其在雷公藤植株中含量極低,植株生長緩慢,雷公藤甲素得率也較低:以上兩種獲取方式難以滿足大量的商業(yè)需求,特別是雷公藤甲素及其衍生物成藥后的產(chǎn)業(yè)化需求;因此,亟需發(fā)展新的策略與技術(shù)來獲取雷公藤甲素等天然活性產(chǎn)物。近年來,隨著合成生物學技術(shù)在紫杉醇、青蒿素和丹參酮等研究及生.產(chǎn)中的成功應用,表明利用合成生物學技術(shù)設計和改造微生物菌株來生產(chǎn)天然活性產(chǎn)物已經(jīng)成為一種極具潛力的獲取新方法。中藥活性成分則是中藥資源的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),其形成是植物次生代謝途徑中特有功能基因群共同調(diào)控的產(chǎn)物;因此本研究的目的在于:通過發(fā)掘調(diào)控雷公藤甲素生物合成的關(guān)鍵功能基因群,解析其生物合成途徑,進而利用合成生物學技術(shù)設計和改造微生物菌株來高效生產(chǎn)雷公藤甲素及其衍生物。本課題組前期利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立了穩(wěn)定可控的雷公藤懸浮細胞培養(yǎng)體系,并已完成雷公藤懸浮細胞轉(zhuǎn)錄組深度測序分析,解析了雷公藤甲素上游生物合成途徑,克隆鑒定了4個二萜合酶(TwCPS1、TwCPS2、TwCPS3、TwKS),證實 TwCPS1 催化 GGPP形成(+)-CPP,TwCPS2無生物活性,TwCPS3催化GGPP形成ent-CPP,TwKS催化ent-CPP形成16α-hydroxy-ent-kaurane和ent-kaurene;然而雷公藤甲素的二萜烯中間體結(jié)構(gòu)還未確定,且催化(+)-CPP形成松香烷型二萜烯中間體的關(guān)鍵酶基因也未鑒定。因此,本研究在推動雷公藤甲素生物合成途徑的解析進程中亟待解決兩個難點:(1)明確雷公藤甲素二萜烯中間體結(jié)構(gòu),(2)明確催化雷公藤甲素二萜烯中間體形成的關(guān)鍵酶基因。為此本研究采用UPLC/Q-TOFMS表征了雷公藤懸浮細胞及培養(yǎng)基、植株不同組織部位之間的代謝物差異,并利用GC-MS在雷公藤懸浮細胞中檢測到松香烷型二萜烯miltiradiene,通過底物飼喂實驗證實miltiradiene為雷公藤甲素二萜烯中間體化合物:基于此,進一步篩選到萜類合酶基因TwMS,其編碼蛋白催化(+)-CPP形成miltiradiene,成功揭示了雷公藤甲素從線性GGPP環(huán)化成松香烷型二萜烯中間體miltiradiene的生物過程。為進一步解析雷公藤甲素生物合成途徑中CYP450參與的下游修飾過程,首先克隆并表征了雷公藤中4條NADPH-細胞色素P450還原酶基因;在此基礎(chǔ)上,通過基因組學、代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學的整合分析,構(gòu)建“CYP450基因-代謝物”的調(diào)控網(wǎng)絡圖,篩選與雷公藤甲素積累呈正相關(guān)的32條候選CYP450基因,結(jié)合不同組織部分轉(zhuǎn)錄組分析,挑選出雷公藤根中高表達的10條CYP450基因,利用基因槍介導遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對上述10條候選CYP450基因進行干擾表達,在CYP728B70,TW011445.1,TW012149.1,TW006625.1干擾細胞系中,基因表達水平及雷公藤甲素含量均顯著下調(diào),經(jīng)酵母工程菌體系成功鑒定了雷公藤甲素生物合成途徑上首個CYP450基因(CYP728B70),體外酶促研究證實其具備連續(xù)兩步氧化雷公藤甲素二萜烯miltiradiene或abietatriene(miltiradiene自氧化產(chǎn)物)形成相應羧酸產(chǎn)物的生物學功能,并進一步構(gòu)建酵母工程菌,大量發(fā)酵富集產(chǎn)物,制備純化,進行高分辨質(zhì)譜以及1H-NMR和13C-NMR鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu),成功解析了雷公藤甲素生物合成途徑下游兩步修飾過程,為雷公藤甲素生物合成途徑全解析及其合成生物學生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.明確雷公藤甲素二萜烯中間體結(jié)構(gòu)采用UPLC/Q-TOF MS檢測并比較雷公藤懸浮細胞及培養(yǎng)基、植株不同組織部位之間的代謝物差異,表明雷公藤懸浮細胞選擇性地富集雷公藤甲素和雷公藤紅素,進一步佐證其可用于解析雷公藤甲素生物合成途徑;利用GC-MS檢測到雷公藤懸浮細胞中含有松香烷型二萜烯miltiradiene,并通過miltiradiene飼喂懸浮細胞,發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素累積量相對于對照組顯著增加,證實miltiradiene為雷公藤甲素二萜烯中間體化合物。2.篩選出調(diào)控雷公藤甲素二萜烯中間體形成的關(guān)鍵候選酶基因深入挖掘雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得二萜合酶基因TwCPS4、TwKSL1全長序列;利用丹參SmMS氨基酸序列作為query序列,與雷公藤懸浮細胞轉(zhuǎn)錄組序列進行比對獲得單萜合酶基因TwMS,生物信息學分析表明:TwCPS4,其N端有‘DxDD'結(jié)構(gòu)功能域,與TwCPS1聚為一類,推測其具有催化GGPP質(zhì)子化并環(huán)化成(+)-CPP的功能;TwKSL1,其C端有‘DDxxD’結(jié)構(gòu)功能域,與TwKS聚為一類,推測其具有催化ent-CPP去磷酸化并環(huán)化成二萜烯的功能;TwMS與TwTPS27聚為一類,推測其具有催化(+)-CPP去磷酸化并環(huán)化成miltiradiene的功能。3.揭示了雷公藤甲素從線性GGPP環(huán)化成松香烷型二萜烯中間體的生物過程克隆得到2條可能參與miltiradiene合成的萜類合酶TwCPS4、TwMS,及1條調(diào)控未知二萜烯合成的萜類合酶TwKSL1,異源表達及體外功能表征證實TwCPS4 催化 GGPP 形成(+)-CPP,TwKSL1 催化 ent-CPP 形成ent-pimara-8(14),15-diene、8α-hydroxy-ent-pimar-15-ene、ent-kaurene,TwMS 催化(+)-CPP 形成 miltiradiene;進一步表征 TwCPS1、TwCPS4、TwMS 的體內(nèi)生物學功能,成功揭示了雷公藤甲素從線性GGPP環(huán)化成松香烷型二萜烯中間體miltiradiene的生物過程,本研究推動了雷公藤甲素生物合成途徑的解析進程,并為下游合成途徑CYP450基因研究奠定基礎(chǔ)。4.雷公藤NADPH-細胞色素P450還原酶基因克隆及功能研究深入挖掘雷公藤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選并克隆得到4條NADPH-細胞色素P450還原酶基因,成功構(gòu)建原核表達載體HIS-MBP-pET28a,并誘導出可溶性蛋白,體外酶活表征顯示4個CPR的酶活性(即供電子能力)基本相同;進一步與已知功能的雷公藤貝殼杉烯氧化酶(TwKO)共轉(zhuǎn)化酵母工程菌,發(fā)現(xiàn)TwKO與CPR3 組合時,ent-kaurenoic acid、16α-hydroxy-ent-kaurenoic acid 的產(chǎn)量相對較高,表明CPR3具有更高效的供電子能力,推測CPR3更適合應用于雷公藤中其他CYP450單加氧酶的功能研究。5.成功鑒定了雷公藤甲素生物合成途徑中首個CYP450基因,解析了雷公藤甲素從miltiradiene氧化成dehydroabietic acid的生物過程整合基因組學、代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù),構(gòu)建“CYP450基因-代謝物”的調(diào)控網(wǎng)絡圖,篩選出與雷公藤甲素積累呈正相關(guān)的32條候選CYP450基因,結(jié)合不同組織部分轉(zhuǎn)錄組分析,挑選出雷公藤根中高表達的10條CYP450基因;利用基因槍介導遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對上述10條候選CYP450基因進行干擾表達,在CYP728B70,TW011445.1,TW012149.1,TW006625.1 干擾細胞系中，基因表達水平及雷公藤甲素含量均顯著下調(diào),結(jié)合CYP728B70的功能注釋信息,推測其可能參與雷公藤二萜烯中間體miltiradiene的氧化反應;經(jīng)酵母工程菌體系確認CYP728B70能夠催化miltiradiene形成新的產(chǎn)物,進而通過大量發(fā)酵、產(chǎn)物制備分離純化、高分辨質(zhì)譜以及1H-NMR和13C-NMR鑒定其產(chǎn)物結(jié)構(gòu),即8,12-abietadienol、dehydroabietinol、8,12-abietadienoic acid、dehydroabietic acid;利用底物飼喂明確了 CYP728B70催化過程,成功解析了雷公藤甲素從miltiradiene氧化成dehydroabietic acid的生物過程;借助基因槍介導轉(zhuǎn)化在雷公藤懸浮細胞中過表達CYP728B70酶基因,進一步表征了 CYP728B70在雷公藤甲素合成過程中的調(diào)控作用。綜上所述,本研究綜合運用了前體底物飼喂、基因克隆及異源表達、體外酶促反應、酵母工程菌、制備產(chǎn)物分離純化、基因槍介導轉(zhuǎn)化的干擾及過表達等技術(shù)對雷公藤中雷公藤甲素生物合成途徑進行解析。本研究成功揭示了雷公藤甲素從線性GGPP環(huán)化成松香烷型二萜烯中間體miltiradiene的生物過程,并進一步鑒定了雷公藤甲素生物合成途徑首個CYP450基因(CYP728B70),證實其完成連續(xù)兩步氧化反應,即氧化二萜烯中間體miltiradiene(或abietatriene)形成8,12-abietadienol(或 dehydroabietinol)并進一步氧化生成 8,12-abietadienoic acid(或dehydroabietic acid)的生物學功能。以上研究成功解析了雷公藤甲素生物合成途徑中從線性GGPP至dehydroabietic acid四步催化過程,為雷公藤甲素生物合成途徑全解析及其合成生物學生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239;Q78
【圖文】：
１．１．３邐二萜活性成分生物合成途徑解析逡逑二萜類活性成分由４個異戊二烯單元組成，是萜類活性成分的重要組成部分，逡逑紫杉醇、銀杏內(nèi)酯、冬凌草素、夏至草素、毛喉素、土槿甲酸、鼠尾草酚、巨大逡逑戟醇、假白欖酮、丹參酮、穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、雷公藤福定、雷公藤甲逡逑素等都是典型的二萜類活性成分，在植物中其主要通過ＭＥＰ途徑生成，在隴牛逡逑兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶（ＧＧＰＰＳ）作用下催化３個丨ＰＰ分子與１個ＤＭＡＰＰ分逡逑１７逡逑
邐中國中醫(yī)科學院２０１６級博士研究生學位論文邐逡逑子首尾相連生成櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸（ＧＧＰＰ），在二萜合酶（ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ逡逑ｓｙｎｔｈａｓｅ）的作用下形成多種多樣的二ＩＳ骨架結(jié)構(gòu)（圖１－２），再通過ＣＹＰ４５０等逡逑后修飾酶的作用形成結(jié)構(gòu)多樣的二萜類活性成分。逡逑
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本文編號：
2722716
