【摘要】：苯丙烷類化合物(如花青素、單寧、黃酮醇和木質(zhì)素等)是楊樹體內(nèi)一類重要的次生代謝產(chǎn)物,其不僅廣泛參與楊樹抗蟲、抗病、抵御紫外輻射和抗衰老等生理過程,還是楊樹木材的重要組分之一。因此,解析楊樹類黃酮和木質(zhì)素的生物合成機制具有重大的科學意義和產(chǎn)業(yè)前景。本論文從楊樹中篩選到了一個可同時影響類黃酮和木質(zhì)素生物合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB93,利用細胞生物學、分子遺傳學和生物化學等實驗手段,解析了MYB93對類黃酮和木質(zhì)素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。本論文主要研究結(jié)果如下:(1)MYB93是一個在葉片、莖干中高水平表達,定位于細胞核的轉(zhuǎn)錄抑制子qRT-PCR分析顯示,在野生型毛白楊中,MYB93在葉片莖干中大量表達。將MYB93啟動子連接GUS報告基因的載體轉(zhuǎn)入毛白楊,GUS染色分析顯示其在老葉和莖中染色程度最深,與qRT-PCR結(jié)果一致。亞細胞定位證明了MYB93定位于細胞核中;酵母自激活實驗證明MYB93具有轉(zhuǎn)錄抑制功能。(2)PtoMYB93抑制了花青素、單寧以及木質(zhì)素的生物合成為闡明MYB93轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能,構(gòu)建其超量表達和CRISPR/Cas9基因敲除的表達載體,轉(zhuǎn)化至野生型毛白楊。表型觀察和組織化學染色分析顯示,在超量表達MYB93的轉(zhuǎn)基因楊樹葉片中,花青素和單寧的含量顯著降低;而在敲除MYB93的楊樹中,花青素和單寧的含量均有所提高。同時,與野生型毛白楊相比,MYB93超量表達轉(zhuǎn)基因的植株高度變矮,莖稈直徑變細,莖部木質(zhì)部細胞層數(shù)變少,木質(zhì)素自發(fā)熒光變?nèi)?木質(zhì)素含量降低;敲除株系雖然呈現(xiàn)相反趨勢,但無顯著差異。qRT-PCR分析顯示,在MYB93超量表達的轉(zhuǎn)基因楊樹中,花青素、單寧及木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵酶的表達水平明顯下調(diào),在MYB93敲除的毛白楊中,它們的表達水平均上調(diào),說明MYB93對花青素、單寧以及木質(zhì)素生物合成的影響可能是通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達來完成。(3)MYB93通過調(diào)控下游酶基因的啟動子,利用EAR結(jié)構(gòu)域抑制關(guān)鍵酶基因的表達通過Effector-Reporter實驗,將MYB93超量表達載體與關(guān)鍵酶基因的啟動子載體共同轉(zhuǎn)化煙草,證明MYB93可調(diào)控花青素、單寧以及木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶基因的啟動子,抑制其表達,從而抑制花青素、單寧及木質(zhì)素的生物合成。前人研究表明,在MYB轉(zhuǎn)錄抑制子中存在EAR結(jié)構(gòu)域,其在花青素和單寧合成中發(fā)揮重要作用。將突變掉EAR(LxLxL)結(jié)構(gòu)域的突變體△MYB93,與關(guān)鍵酶基因啟動子進行瞬時表達分析顯示,突變掉EAR結(jié)構(gòu)域后,△MYB93對下游酶基因啟動子的抑制調(diào)控功能缺失。暗示MYB93對花青素、單寧及木質(zhì)素合成的抑制作用可能是通過EAR結(jié)構(gòu)域完成的。(4)MYB93與TT8、TTG1形成MBW復(fù)合體,可以增強MYB93對花青素和單寧生物合成的抑制功能研究表明,在類黃酮生物合成中,MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白可以形成MBW復(fù)合體,增強MYB轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的激活或抑制功能。在煙草葉片中瞬時表達分析顯示,當加入TT8、TTG1時,MYB93對類黃酮途徑中關(guān)鍵酶基因的抑制作用增強。酵母雙雜交的實驗證明MYB93與TT8存在直接相互作用,TT8作為橋梁使其與MYB93、TTG1形成MBW復(fù)合體來負調(diào)控類黃酮途徑的生物合成。(5)MYB93和MYB57轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能差異的分子機制分析MYB93和MYB57均為擬南芥AtMYB4的同源基因,但MYB93可同時抑制花青素、單寧及木質(zhì)素的生物合成,而MYB57僅能抑制花青素和單寧的合成,二者在調(diào)控功能上存在明顯差異。組織表達特異性分析顯示,MYB93在葉片、木質(zhì)部和韌皮部等組織均具有較高的表達水平,而MYB57僅在葉片具有較高表達水平,在木質(zhì)部和韌皮部表達水平極低,暗示其不參與木質(zhì)素的合成調(diào)控。qRT-PCR和瞬時表達分析顯示,MYB57不能結(jié)合到木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的啟動子上,調(diào)控其表達。綜上所述,本研究初步證明,MYB93作為轉(zhuǎn)錄抑制因子,其通過與TT8、TTG1形成MBW復(fù)合體,抑制類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達活性,從而負調(diào)控花青素和單寧的生物合成。同時,MYB93也可通過下調(diào)木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達,抑制木質(zhì)素的生物合成。本論文研究結(jié)果為解析楊樹中苯丙烷代謝的分子遺傳機制提供了新的證據(jù),也為林木育種和木材優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

西南大學碩士學位論文[14]，依據(jù)結(jié)構(gòu)差異，在高等植物中將類黃酮類化合物大致化分為 6 種不同的類型[16]，分別為：查耳酮（Chalcones）、黃酮（Flavones）、黃酮醇（Flavonols）、黃烷雙醇（Flavandiols）、花色素苷（Anthocyanins）和單寧（Condensed tannins 或proanthocyanidins），另外還包含一些衍生物。其中一些黃酮類的化合物分類結(jié)構(gòu)如圖 1.2[17]。

圖 1.3 木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)a.愈創(chuàng)木基丙烷; b.紫丁香基丙烷; c.對羥苯基丙烷。Fig 1.3 Structure of lignin monomera. guaiacyl propane; b. syringylpropane; c. phydroxyphenyl propane.1.3.4 影響苯丙烷類化合物生物合成的因素苯丙烷代謝途徑的生物合成受植物自身生長發(fā)育，外界環(huán)境和壓力等相關(guān)因素的影響，受到關(guān)鍵酶基因的精細調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF)的嚴格調(diào)控[38]。關(guān)鍵酶基因的表達對苯丙烷類化合物生物合成的整體穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，單個酶基因的沉默，過表達或異源表達均會導(dǎo)致靶組織中相對組成的變化[39]。UFGT基因的表達決定花青素的穩(wěn)定性，Lo Piero 等研究發(fā)現(xiàn)，在血橙的汁液囊泡檢測到大量 UFGT 轉(zhuǎn)錄物，而在普通甜橙（Citrus sinensis）中含量很少[40]；Fang 等研究表明，在桃（Prunus persica）花的生長發(fā)育過程中，總的花青素含量最初在桃花發(fā)育期間增加，隨時間推移，四種花色素苷生物合成基因的表達也隨之增加直

【參考文獻】

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1 趙雪巍;劉培玉;劉丹;孫珊珊;李貞;余可馨;張Z誒

本文編號：2722679