【摘要】：揚(yáng)子鱷(Chinese alligator,Alligator sinensis),中國(guó)特有的瀕危爬行動(dòng)物,國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物,是世界現(xiàn)存的23種鱷類中的一員。作為一種半水生的食肉動(dòng)物,揚(yáng)子鱷無(wú)時(shí)無(wú)刻不經(jīng)受來(lái)著環(huán)境和腸道病源微生物的潛在威脅。鱷類血清中存在具有廣譜抗菌活性的抗菌肽類物質(zhì),其中β防御素(β-defensin)即是抗菌肽的一種,其構(gòu)成動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)的第一道屏障。不同于在哺乳動(dòng)物和鳥類中對(duì)β防御素的廣泛研究,關(guān)于爬行動(dòng)物β防御素的信息則相對(duì)有限,在鱷目中甚至還未曾有β防御素的報(bào)道。揚(yáng)子鱷還是一種具有冬眠習(xí)性的變溫爬行動(dòng)物。由于寒季環(huán)境溫度的下降和食物的減少,揚(yáng)子鱷在冬眠期間保持深度休眠、低代謝率和禁食的生理狀態(tài)�；谥�16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序的研究表明,冬眠動(dòng)物的腸道微生物群落組成和結(jié)構(gòu)會(huì)隨著宿主生理狀態(tài)和食物攝入量的變化而呈現(xiàn)季節(jié)性波動(dòng)。但從宏基因組水平對(duì)冬眠動(dòng)物腸道微生物組在功能上的季節(jié)性變化的研究卻鮮有耳聞;此外,冬眠宿主腸道黏膜及其免疫屏障與腸道菌群之間的季節(jié)性互作機(jī)理也尚不明確。因此,揚(yáng)子鱷是我們研究冬眠引起的腸道菌群結(jié)構(gòu)、功能改變和腸道免疫應(yīng)答的天然理想模型。本研究中,我們通過(guò)生物信息學(xué)手段和RACE-PCR的方法在揚(yáng)子鱷基因組scaffold687_1上鑒定到一個(gè)長(zhǎng)390 kb的β防御素基因簇,由20個(gè)新的鱷類β防御素基因(AsBDs,Alligator sinensisβ-defensin genes)組成。通過(guò)對(duì)揚(yáng)子鱷β防御素的基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、系統(tǒng)進(jìn)化以及組織表達(dá)的解析,揭示了揚(yáng)子鱷旁系A(chǔ)sBDs與哺乳動(dòng)物α防御素在基因演化和功能上具有高度的相似性,為后續(xù)進(jìn)行的β防御素與腸道微生物的關(guān)聯(lián)研究奠定了基礎(chǔ)。針對(duì)揚(yáng)子鱷腸道微生物的研究,我們通過(guò)對(duì)冬眠期和活躍期的揚(yáng)子鱷消化道各段(胃、小腸和結(jié)腸)內(nèi)容物和糞便樣品進(jìn)行16S rRNA V3-V4高變區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序,并對(duì)糞便樣品進(jìn)行宏基因組de novo測(cè)序,以揭示其腸道微生物在優(yōu)勢(shì)菌群組成、菌群結(jié)構(gòu)、群落多樣性和預(yù)測(cè)功能上的季節(jié)性變化規(guī)律;并探討了揚(yáng)子鱷AsBDs在腸道組織中的季節(jié)性表達(dá)模式與腸道菌群的關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下:(1)揚(yáng)子鱷β防御素基因簇包含6個(gè)鳥類同源的直系A(chǔ)sBDs和9個(gè)爬行動(dòng)物特有的旁系同源AsBDs。旁系A(chǔ)sBDs擁有一段較長(zhǎng)的(36~60個(gè)氨基酸)連接肽段(Pro-piece),與哺乳動(dòng)物α防御素的長(zhǎng)連接肽段序列特征極為相似。由于二者擁有長(zhǎng)度相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?致使旁系A(chǔ)sBDs和哺乳動(dòng)物α防御素在電荷數(shù)和疏水性等理化性質(zhì)上也保持高度的相似性。(2)旁系和直系A(chǔ)sBDs的“信號(hào)肽-連接肽”區(qū)段所受選擇壓力無(wú)明顯差異(旁系:ω=0.759;直系:ω=0.604,p=0.471),二者ω值均小于1,經(jīng)受純化選擇。旁系A(chǔ)sBDs成熟肽的ω值則顯著高于直系A(chǔ)sBDs成熟肽(旁系:ω=1.208;直系:ω=0.499;p=0.034),表明旁系A(chǔ)sBDs成熟肽經(jīng)歷了更強(qiáng)烈的正選擇壓力;與哺乳動(dòng)物α防御素成熟肽的進(jìn)化方向一致。進(jìn)化樹結(jié)果顯示旁系A(chǔ)sBDs與哺乳動(dòng)物α防御素聚為一枝,暗示α防御素在進(jìn)化上可能起源于爬行動(dòng)物旁系A(chǔ)sBDs。(3)揚(yáng)子鱷β防御素基因在各器官組織中的表達(dá)具有普遍性和差異性的特征。總體上,各AsBDs在消化道、脾、肝和腎等部位的表達(dá)量較高,在肌肉、膽囊和心臟中表達(dá)水平相對(duì)較低。旁系A(chǔ)sBDs在腸道各段的表達(dá)水平顯著高于直系A(chǔ)sBDs在腸道相同部位的表達(dá)量,與同樣在腸道中具有高表達(dá)特點(diǎn)的α防御素相似,暗示二者在表達(dá)和功能上也具有一定的相似性。(4)通過(guò)16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序我們?cè)趽P(yáng)子鱷腸道中鑒定到41個(gè)細(xì)菌門類和3215個(gè)OTUs。其中,變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和硬壁菌門(Firmicutes)為揚(yáng)子鱷腸道微生物門水平的四大優(yōu)勢(shì)菌門,共同占比超過(guò)80%�；诤昊蚪Mde novo測(cè)序,我們?cè)趽P(yáng)子鱷糞便樣本中共鑒定到51個(gè)細(xì)菌門和3907個(gè)細(xì)菌種,優(yōu)勢(shì)菌群在門和屬水平上的分布情況與16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果一致。(5)通過(guò)對(duì)不同季節(jié)的所有24個(gè)腸道微生物樣本進(jìn)行主成分分析(PCoA)、聚類分析(UPGMA)、相似性檢驗(yàn)(ANOSIM)和典型相關(guān)性分析(CCA),結(jié)果均顯示冬眠期和活躍期的揚(yáng)子鱷腸道菌群在組成和結(jié)構(gòu)上存在明顯季節(jié)差異。環(huán)境溫度和冬眠禁食是塑造揚(yáng)子鱷腸道微生物群落的兩個(gè)主要環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子。此外,考慮到活躍期揚(yáng)子鱷的糞便與結(jié)腸處微生物群落在組成和結(jié)構(gòu)上具有的較高相似度,我們提出在對(duì)瀕危動(dòng)物的腸道微生物進(jìn)行研究時(shí),建議使用糞便樣本替代結(jié)腸樣品的非損傷性取樣策略。(6)擬桿門菌(Bacteroidetes)及其分類下的擬桿菌屬(Bacteroides)是冬眠期揚(yáng)子鱷腸道中顯著大量富集的冬眠特異微生物群落,占比分別達(dá)到57.95%和55.82%。該門類的微生物具有強(qiáng)大的降解利用宿主來(lái)源底物——粘蛋白糖苷(Mucin glycan)的能力�；贑AZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果,我們總共在揚(yáng)子鱷腸道宏基因組中鑒定到193個(gè)碳水化合物酶家族(CAZymes families)和458個(gè)碳水化合物酶(CAZymes)。其中有14個(gè)涉及降解和結(jié)合粘蛋白糖苷的碳水化合物酶家族和28種粘蛋白寡糖降解酶(Mucin oligosaccharide-degrading enzymes)在冬眠期顯著富集,且其相對(duì)豐度顯著高于活躍期。我們?cè)诩?xì)菌和宏基因組水平揭示了冬眠期腸道特異性微生物通過(guò)降解利用宿主來(lái)源的粘蛋白糖苷維持生命,以適應(yīng)宿主冬眠禁食期間腸道內(nèi)食物匱乏的分子機(jī)制。(7)活躍期揚(yáng)子鱷消化道后段聚集著高豐度的梭桿菌門(Fusobacteria)微生物(20.37%~41.22%),具有典型的食肉動(dòng)物腸道微生物群落特征。梭桿菌門(Fusobacteria)分類下貢獻(xiàn)了95%占比的是一種具有蛋白水解功能的細(xì)菌——Cetobacterium somerae,該菌在活躍期消化道后段大量富集,其相對(duì)豐度顯著高于冬眠期(活躍期vs.冬眠期:小腸:17.81%vs.0.09%,p=0.05;結(jié)腸:31.40%vs.0.35%,p=0.002;糞便:33.91%vs.0.81%,p=0.038)。除了高豐度的C.somerae,我們還檢測(cè)到其它20種同樣具有水解蛋白質(zhì)、多肽和發(fā)酵氨基酸能力的細(xì)菌在活躍期揚(yáng)子鱷腸道內(nèi)顯著富集,表明活躍期正常進(jìn)食的揚(yáng)子鱷腸道內(nèi)大量聚集的蛋白質(zhì)降解微生物以適應(yīng)宿主高蛋白的飲食結(jié)構(gòu),對(duì)動(dòng)物源性食物的細(xì)菌性降解和發(fā)酵有利于宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更高效地消化利用。(8)揚(yáng)子鱷腸道內(nèi)病源微生物分布和免疫相關(guān)基因季節(jié)性表達(dá)的相關(guān)性研究結(jié)果顯示,揚(yáng)子鱷腸道中檢測(cè)到機(jī)會(huì)病原菌在不同季節(jié)均有分布,但活躍期腸道中存在更多的常見致病菌和病毒序列(活躍期vs.冬眠期:4.03%vs.0.04%)。三個(gè)旁系β防御素(AsBD105α,105θ和105α)和MHC I1327基因在冬眠期腸道組織中的顯著性高表達(dá)可能是應(yīng)對(duì)冬眠期細(xì)菌性粘蛋白降解導(dǎo)致黏膜屏障減弱的免疫補(bǔ)償機(jī)制;直系β防御素(AsBD5,AsBD10和AsBD13)、MHC beta和TLR-2基因的表達(dá)量則在活躍期顯著地高于冬眠期,以抵御活躍期腸道內(nèi)更多的病源微生物的入侵。得益于腸道免疫基因與腸道菌群的季節(jié)性互作反饋機(jī)制,揚(yáng)子鱷得以維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)并保障機(jī)體的健康。綜上所述,揚(yáng)子鱷β防御素基因簇的解析為后續(xù)研究其它動(dòng)物類群尤其是爬行動(dòng)物β防御素的進(jìn)化研究提供了基礎(chǔ)信息;為理解我國(guó)特有珍稀動(dòng)物揚(yáng)子鱷的免疫適應(yīng)機(jī)制提供了重要參考;對(duì)未來(lái)開發(fā)新的抗生素類藥物提供了重要的理論和應(yīng)用依據(jù)。同時(shí),在瀕危動(dòng)物的系統(tǒng)性保護(hù)工程中,我們呼吁相關(guān)從業(yè)人員應(yīng)更多地關(guān)注動(dòng)物腸道微生物多樣性保護(hù)。揚(yáng)子鱷腸道微生物組的研究結(jié)果在瀕危動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)研究以及“宿主-微生物”共生體在能量代謝和免疫應(yīng)答方面的互作機(jī)理具有重要實(shí)用意義和理論價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q953
【圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文 （第一部分）第一章 文獻(xiàn)綜述的分布區(qū)域逐漸縮小，僅在長(zhǎng)江中下游部分地區(qū)尚有分布（Thorbjarnarson, 1999）中美專家在1981年組成聯(lián)合調(diào)查組調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，野生揚(yáng)子鱷的數(shù)量?jī)H有300～500 條，分布區(qū)域僅在長(zhǎng)江中游一帶（北緯 30.6～31.6 度，東經(jīng) 118～119.6 度狹小的范圍內(nèi)）（渡部摩娜等, 1982）。在 1998～2003 年間，丁由中等人（2004）對(duì)可能有野生揚(yáng)子鱷生存的蘇、浙、皖三省的 45 個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行走訪調(diào)查。結(jié)果顯示，野生揚(yáng)子鱷個(gè)體總數(shù)大約在 120 條左右，主要分布在安徽揚(yáng)子鱷國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。

結(jié)構(gòu)形勢(shì)（C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C-C），其 6 個(gè)半胱氨酸通過(guò)三個(gè)二硫鍵，以 C1-C5，C2-C4 和 C3-C6 的半胱氨酸配對(duì)形式連接（圖 1.2）（Hazlett, et al., 2014;Jarczak, et al., 2013）。在酸性環(huán)境下，二硫鍵能夠抵抗蛋白水解作用來(lái)幫助防御素維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，成熟的 β 防御素由三個(gè) β 鏈反向平行折疊排列構(gòu)成 β 折疊。β折疊使蛋白具有疏水性，以此來(lái)維持分子的功能穩(wěn)定，也是 β 防御素在不同環(huán)境下能維持其抗菌活性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（Shafee, et al., 2016）。β 防御素的抗菌活性由其蛋白質(zhì)電勢(shì)和疏水性決定（Klüver, et al., 2006）。β 防御素的表面電勢(shì)分布賦予了它能夠滲透進(jìn)微生物細(xì)胞膜的能力。表面膜電勢(shì)的分布決定了 β 防御素的功能特異性，不同 β 防御素表面膜電勢(shì)的分布差異決定了每個(gè)防御素蛋白具有獨(dú)特的抗菌能力（Tu, et al., 2015）。防御素之間的另一個(gè)明顯差異是蛋白結(jié)構(gòu)環(huán)形大小和方位的不同，細(xì)微的尺寸和方位的改變都能導(dǎo)致折疊結(jié)構(gòu)和蛋白構(gòu)成的差異（Soares, et al., 2004）。β 防御素?fù)碛械牟町惢谋砻骐妱?shì)和不同的蛋白結(jié)構(gòu)使其具有特異性的抗菌效力和多樣化的功能活性（Tu, et al., 2015）。

本文編號(hào)：2719846