【摘要】：揚子鱷(Chinese alligator,Alligator sinensis),中國特有的瀕危爬行動物,國家一級保護動物,是世界現(xiàn)存的23種鱷類中的一員。作為一種半水生的食肉動物,揚子鱷無時無刻不經(jīng)受來著環(huán)境和腸道病源微生物的潛在威脅。鱷類血清中存在具有廣譜抗菌活性的抗菌肽類物質,其中β防御素(β-defensin)即是抗菌肽的一種,其構成動物先天性免疫系統(tǒng)的第一道屏障。不同于在哺乳動物和鳥類中對β防御素的廣泛研究,關于爬行動物β防御素的信息則相對有限,在鱷目中甚至還未曾有β防御素的報道。揚子鱷還是一種具有冬眠習性的變溫爬行動物。由于寒季環(huán)境溫度的下降和食物的減少,揚子鱷在冬眠期間保持深度休眠、低代謝率和禁食的生理狀態(tài)�；谥�16S rRNA擴增子測序的研究表明,冬眠動物的腸道微生物群落組成和結構會隨著宿主生理狀態(tài)和食物攝入量的變化而呈現(xiàn)季節(jié)性波動。但從宏基因組水平對冬眠動物腸道微生物組在功能上的季節(jié)性變化的研究卻鮮有耳聞;此外,冬眠宿主腸道黏膜及其免疫屏障與腸道菌群之間的季節(jié)性互作機理也尚不明確。因此,揚子鱷是我們研究冬眠引起的腸道菌群結構、功能改變和腸道免疫應答的天然理想模型。本研究中,我們通過生物信息學手段和RACE-PCR的方法在揚子鱷基因組scaffold687_1上鑒定到一個長390 kb的β防御素基因簇,由20個新的鱷類β防御素基因(AsBDs,Alligator sinensisβ-defensin genes)組成。通過對揚子鱷β防御素的基因結構、氨基酸序列、系統(tǒng)進化以及組織表達的解析,揭示了揚子鱷旁系AsBDs與哺乳動物α防御素在基因演化和功能上具有高度的相似性,為后續(xù)進行的β防御素與腸道微生物的關聯(lián)研究奠定了基礎。針對揚子鱷腸道微生物的研究,我們通過對冬眠期和活躍期的揚子鱷消化道各段(胃、小腸和結腸)內(nèi)容物和糞便樣品進行16S rRNA V3-V4高變區(qū)擴增子測序,并對糞便樣品進行宏基因組de novo測序,以揭示其腸道微生物在優(yōu)勢菌群組成、菌群結構、群落多樣性和預測功能上的季節(jié)性變化規(guī)律;并探討了揚子鱷AsBDs在腸道組織中的季節(jié)性表達模式與腸道菌群的關系。主要的研究結果如下:(1)揚子鱷β防御素基因簇包含6個鳥類同源的直系AsBDs和9個爬行動物特有的旁系同源AsBDs。旁系AsBDs擁有一段較長的(36~60個氨基酸)連接肽段(Pro-piece),與哺乳動物α防御素的長連接肽段序列特征極為相似。由于二者擁有長度相當?shù)陌被嵝蛄?致使旁系AsBDs和哺乳動物α防御素在電荷數(shù)和疏水性等理化性質上也保持高度的相似性。(2)旁系和直系AsBDs的“信號肽-連接肽”區(qū)段所受選擇壓力無明顯差異(旁系:ω=0.759;直系:ω=0.604,p=0.471),二者ω值均小于1,經(jīng)受純化選擇。旁系AsBDs成熟肽的ω值則顯著高于直系AsBDs成熟肽(旁系:ω=1.208;直系:ω=0.499;p=0.034),表明旁系AsBDs成熟肽經(jīng)歷了更強烈的正選擇壓力;與哺乳動物α防御素成熟肽的進化方向一致。進化樹結果顯示旁系AsBDs與哺乳動物α防御素聚為一枝,暗示α防御素在進化上可能起源于爬行動物旁系AsBDs。(3)揚子鱷β防御素基因在各器官組織中的表達具有普遍性和差異性的特征�？傮w上,各AsBDs在消化道、脾、肝和腎等部位的表達量較高,在肌肉、膽囊和心臟中表達水平相對較低。旁系AsBDs在腸道各段的表達水平顯著高于直系AsBDs在腸道相同部位的表達量,與同樣在腸道中具有高表達特點的α防御素相似,暗示二者在表達和功能上也具有一定的相似性。(4)通過16S rRNA擴增子測序我們在揚子鱷腸道中鑒定到41個細菌門類和3215個OTUs。其中,變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和硬壁菌門(Firmicutes)為揚子鱷腸道微生物門水平的四大優(yōu)勢菌門,共同占比超過80%�；诤昊蚪Mde novo測序,我們在揚子鱷糞便樣本中共鑒定到51個細菌門和3907個細菌種,優(yōu)勢菌群在門和屬水平上的分布情況與16S rRNA擴增子測序結果一致。(5)通過對不同季節(jié)的所有24個腸道微生物樣本進行主成分分析(PCoA)、聚類分析(UPGMA)、相似性檢驗(ANOSIM)和典型相關性分析(CCA),結果均顯示冬眠期和活躍期的揚子鱷腸道菌群在組成和結構上存在明顯季節(jié)差異。環(huán)境溫度和冬眠禁食是塑造揚子鱷腸道微生物群落的兩個主要環(huán)境驅動因子。此外,考慮到活躍期揚子鱷的糞便與結腸處微生物群落在組成和結構上具有的較高相似度,我們提出在對瀕危動物的腸道微生物進行研究時,建議使用糞便樣本替代結腸樣品的非損傷性取樣策略。(6)擬桿門菌(Bacteroidetes)及其分類下的擬桿菌屬(Bacteroides)是冬眠期揚子鱷腸道中顯著大量富集的冬眠特異微生物群落,占比分別達到57.95%和55.82%。該門類的微生物具有強大的降解利用宿主來源底物——粘蛋白糖苷(Mucin glycan)的能力。基于CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結果,我們總共在揚子鱷腸道宏基因組中鑒定到193個碳水化合物酶家族(CAZymes families)和458個碳水化合物酶(CAZymes)。其中有14個涉及降解和結合粘蛋白糖苷的碳水化合物酶家族和28種粘蛋白寡糖降解酶(Mucin oligosaccharide-degrading enzymes)在冬眠期顯著富集,且其相對豐度顯著高于活躍期。我們在細菌和宏基因組水平揭示了冬眠期腸道特異性微生物通過降解利用宿主來源的粘蛋白糖苷維持生命,以適應宿主冬眠禁食期間腸道內(nèi)食物匱乏的分子機制。(7)活躍期揚子鱷消化道后段聚集著高豐度的梭桿菌門(Fusobacteria)微生物(20.37%~41.22%),具有典型的食肉動物腸道微生物群落特征。梭桿菌門(Fusobacteria)分類下貢獻了95%占比的是一種具有蛋白水解功能的細菌——Cetobacterium somerae,該菌在活躍期消化道后段大量富集,其相對豐度顯著高于冬眠期(活躍期vs.冬眠期:小腸:17.81%vs.0.09%,p=0.05;結腸:31.40%vs.0.35%,p=0.002;糞便:33.91%vs.0.81%,p=0.038)。除了高豐度的C.somerae,我們還檢測到其它20種同樣具有水解蛋白質、多肽和發(fā)酵氨基酸能力的細菌在活躍期揚子鱷腸道內(nèi)顯著富集,表明活躍期正常進食的揚子鱷腸道內(nèi)大量聚集的蛋白質降解微生物以適應宿主高蛋白的飲食結構,對動物源性食物的細菌性降解和發(fā)酵有利于宿主對營養(yǎng)物質更高效地消化利用。(8)揚子鱷腸道內(nèi)病源微生物分布和免疫相關基因季節(jié)性表達的相關性研究結果顯示,揚子鱷腸道中檢測到機會病原菌在不同季節(jié)均有分布,但活躍期腸道中存在更多的常見致病菌和病毒序列(活躍期vs.冬眠期:4.03%vs.0.04%)。三個旁系β防御素(AsBD105α,105θ和105α)和MHC I1327基因在冬眠期腸道組織中的顯著性高表達可能是應對冬眠期細菌性粘蛋白降解導致黏膜屏障減弱的免疫補償機制;直系β防御素(AsBD5,AsBD10和AsBD13)、MHC beta和TLR-2基因的表達量則在活躍期顯著地高于冬眠期,以抵御活躍期腸道內(nèi)更多的病源微生物的入侵。得益于腸道免疫基因與腸道菌群的季節(jié)性互作反饋機制,揚子鱷得以維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)并保障機體的健康。綜上所述,揚子鱷β防御素基因簇的解析為后續(xù)研究其它動物類群尤其是爬行動物β防御素的進化研究提供了基礎信息;為理解我國特有珍稀動物揚子鱷的免疫適應機制提供了重要參考;對未來開發(fā)新的抗生素類藥物提供了重要的理論和應用依據(jù)。同時,在瀕危動物的系統(tǒng)性保護工程中,我們呼吁相關從業(yè)人員應更多地關注動物腸道微生物多樣性保護。揚子鱷腸道微生物組的研究結果在瀕危動物保護生物學研究以及“宿主-微生物”共生體在能量代謝和免疫應答方面的互作機理具有重要實用意義和理論價值。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q953
【圖文】：

浙江大學博士學位論文 （第一部分）第一章 文獻綜述的分布區(qū)域逐漸縮小，僅在長江中下游部分地區(qū)尚有分布（Thorbjarnarson, 1999）中美專家在1981年組成聯(lián)合調(diào)查組調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，野生揚子鱷的數(shù)量僅有300～500 條，分布區(qū)域僅在長江中游一帶（北緯 30.6～31.6 度，東經(jīng) 118～119.6 度狹小的范圍內(nèi)）（渡部摩娜等, 1982）。在 1998～2003 年間，丁由中等人（2004）對可能有野生揚子鱷生存的蘇、浙、皖三省的 45 個地點進行走訪調(diào)查。結果顯示，野生揚子鱷個體總數(shù)大約在 120 條左右，主要分布在安徽揚子鱷國家級自然保護區(qū)內(nèi)。

結構形勢（C-X4-8-C-X3-5-C-X9-13-C-X4-7-C-C），其 6 個半胱氨酸通過三個二硫鍵，以 C1-C5，C2-C4 和 C3-C6 的半胱氨酸配對形式連接（圖 1.2）（Hazlett, et al., 2014;Jarczak, et al., 2013）。在酸性環(huán)境下，二硫鍵能夠抵抗蛋白水解作用來幫助防御素維持結構穩(wěn)定，成熟的 β 防御素由三個 β 鏈反向平行折疊排列構成 β 折疊。β折疊使蛋白具有疏水性，以此來維持分子的功能穩(wěn)定，也是 β 防御素在不同環(huán)境下能維持其抗菌活性的重要結構基礎（Shafee, et al., 2016）。β 防御素的抗菌活性由其蛋白質電勢和疏水性決定（Klüver, et al., 2006）。β 防御素的表面電勢分布賦予了它能夠滲透進微生物細胞膜的能力。表面膜電勢的分布決定了 β 防御素的功能特異性，不同 β 防御素表面膜電勢的分布差異決定了每個防御素蛋白具有獨特的抗菌能力（Tu, et al., 2015）。防御素之間的另一個明顯差異是蛋白結構環(huán)形大小和方位的不同，細微的尺寸和方位的改變都能導致折疊結構和蛋白構成的差異（Soares, et al., 2004）。β 防御素擁有的差異化的表面電勢和不同的蛋白結構使其具有特異性的抗菌效力和多樣化的功能活性（Tu, et al., 2015）。

本文編號：2719846