【摘要】：蔬果類發(fā)酵腌制食品可以通過微生物主導的亞硝酸鹽酶降解和酸降解兩種途徑降低亞硝酸鹽濃度。酸降解的研究較為透徹,廣泛應用于發(fā)酵食品乳酸菌直投生產(chǎn)中。然而,酸降解不能消除過量農(nóng)業(yè)氮肥施用造成的蔬果內(nèi)高濃度的硝酸鹽。這些硝酸鹽進行人體后可被棲息于中性腸道的微生物還原,形成二次亞硝酸鹽危害。因此,蔬果發(fā)酵腌制過程中,硝酸鹽和亞硝酸鹽的微生物酶降解機制的解析和應用具有重要意義。本論文以東北酸菜為對象進行發(fā)酵腌制模擬實驗,參考氮素的生物化學地球循環(huán)途徑和特征,通過對東北酸菜固體和發(fā)酵液液體理化性質(zhì)、微生物轉(zhuǎn)化氮素的功能基因豐度和細菌群落結構多樣性的動態(tài)監(jiān)測,明確東北酸菜腌制過程中亞硝酸鹽酶降解的微生物途徑和類群。同時,參考發(fā)酵液中酶降解底物的類型設計相應微生物特異性培養(yǎng)基分離具有酶降解功能的微生物菌株。最后進行多菌株的復合直投的初步試驗。主要研究內(nèi)容如下:(1)東北酸菜發(fā)酵過程亞硝酸鹽酶降解途徑研究。實驗室模擬東北酸菜發(fā)酵條件進行了37天的連續(xù)動態(tài)監(jiān)測。通過東北酸菜發(fā)酵液pH的動態(tài)監(jiān)測將亞硝酸鹽降解過程分為以酶降解為主的階段(1-15天)和以酸降解為主的階段(17-37天)。采用顯色法、離子色譜法檢測發(fā)酵液中氮素化合物(銨鹽、亞硝酸鹽與硝酸鹽)濃度的動態(tài)變化。在酶降解階段,亞硝酸鹽濃度先逐漸升高,并在7天達到超過國標的峰值31.29mg/kg,然后下降至0.42 mg/kg。同時,檢測到整個發(fā)酵過程中銨鹽濃度變化較小且濃度遠低于同時期的亞硝酸鹽濃度,推測東北酸菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽酶降解來源于微生物的反硝化作用�；诜聪趸δ芑騨ir的實時熒光定量PCR檢測,驗證了上述結果同時明確了具有nirSC_1基因型、nirKC_5基因型與nirKC_2基因型的微生物類群在東北酸菜酶降解過程中發(fā)揮了重要作用。通過高效液相法測定反硝化作用底物有機酸結果表明,酸菜發(fā)酵前期反硝化微生物類群最可能利用的碳源包括草酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、丙酸、酒石酸、乳酸8種。(2)東北酸菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽酶降解微生物類群解析。通過構建東北酸菜不同時期發(fā)酵液樣品的高通量測序文庫,對發(fā)酵過程細菌群落結構多樣性進行了解析�；诩毦鶲TU的文庫稀釋曲線、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、群落結構PCoA分析和物種注釋等結果均表明東北酸菜發(fā)酵過程中,細菌群落結構發(fā)生明顯演替過程。在亞硝酸鹽酶降解階段,假單胞菌目(Pseudomonadales)的假單胞菌屬(Pseudomonas),乳桿菌目(Lactobacillales)的明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏屬(weissella),以及腸桿菌目(Enterobacteriales)未知新種細菌最為優(yōu)勢,且這些優(yōu)勢細菌類群相對豐度伴隨發(fā)酵液中硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度的動態(tài)變化而改變,是東北酸菜發(fā)酵前期亞硝酸鹽酶降解階段關鍵微生物類群。(3)硝酸鹽和亞硝酸鹽酶降解微生物分離和鑒定。以硝酸鹽和亞硝酸鹽作為氮源底物,以上述8種有機酸混合作為碳源電子供體,以有氧和無氧為限制條件,培養(yǎng)分離得到發(fā)酵液中具有同時降解硝酸鹽與亞硝酸鹽能力的細菌菌株133株。經(jīng)過反硝化能力檢測確定來自腸桿菌目(Enterobacteriales)的腸桿菌屬Enterobacter、金黃桿菌Chryseobacterium、勞特菌屬Raoultella和歐文氏屬Kluyvera,乳桿菌目(Lactobacillales)的腸球菌屬和明串珠菌屬的細菌菌株,具有同時降解硝酸鹽和亞硝酸鹽能力。另獲得2株腸桿菌屬和1株金黃桿菌屬的新種菌株。(4)雙重還原功能菌株的直投發(fā)酵應用。從安全性出發(fā)選擇明串珠菌菌株Leuconostoc citreum FXLB-3S2和腸球菌Enterococcus casseliflavus NXBC-1S2作為同時具有硝酸鹽和亞硝酸鹽酶降解能力的菌株。輔助分離得到的乳桿菌Lactobacillus plantarum PXLB-1S1進行單菌直投與復合直投發(fā)酵實驗。直投結果表明復合發(fā)酵可將東北酸菜固體硝酸鹽降解率由75%提高至84%,液體中硝酸鹽降解率可達48%,且發(fā)酵過程中無亞硝酸鹽積累。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS255.53;TS201.3
【圖文】：

江蘇大學碩士學位論文1.2 亞硝酸鹽相關的微生物氮素循環(huán)亞硝酸鹽是氮素生物地球化學循環(huán)的中心，其生成與降解途徑多種多樣，作用微生物也多種多樣。生物地球化學循環(huán)中的氮素循環(huán)途徑中，不同生成降解和途徑中關鍵基因不同，反應底物與產(chǎn)物也均不相同。其中亞硝酸鹽可能經(jīng)過以下 4 種微生物代謝途徑進行轉(zhuǎn)化：1、反硝化作用（Denitrification）；2、硝酸鹽氨化作用（Dissimilatorynitrate reduction to ammonium, DNRA）；3、厭氧氨氧化作用（Anammox）；4、硝化作用（Nitrification），反應式如圖 1.1[22]。

北酸菜發(fā)酵過程亞硝酸鹽微生物酶降解機制及應對其他微生物的生長有抑制作用，從而忽略養(yǎng)基的設計是解析酸菜發(fā)酵過程中酶降解位較低，在微生物代謝過程中極易成為電子鹽、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)氮素釋放（圖 1.2同有機酸鹽作為碳源，硝酸鹽、亞硝酸鹽作東北酸菜發(fā)酵過程中有機酸、硝酸鹽、亞硝底物是酸菜發(fā)酵系統(tǒng)中微生物可利用的多種培養(yǎng)基可準確地分離酸菜發(fā)酵液中的亞硝酸

【參考文獻】

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本文編號：2715494