發(fā)布時間：2020-06-16 10:12

【摘要】：谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)是一種不具有CRISPR-Cas系統(tǒng)的生產(chǎn)氨基酸的重要工業(yè)微生物,在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生許多有用的代謝產(chǎn)物,如:谷氨酸、丁二烯等,在工業(yè)生產(chǎn)中有非常重要的地位。隨著基因工程和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展,很多研究人員試圖在基因水平上人工掌控微生物的生長和代謝,以使利益最大化。但因谷氨酸棒狀桿菌與Cas9存在生物相容性問題(表達Cas9的菌株無法生長),目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)無法直接應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯中�；蚪M編輯技術(shù)(簡稱基因編輯技術(shù))與常說的基因工程一樣都是改變細胞的遺傳特性,但不同點主要在于基因編輯技術(shù)直接針對細胞的染色體,從而使其功能遠大于依靠載體的傳統(tǒng)基因工程。CRISPR-Cas是原核中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng),是最前沿的基因編輯技術(shù),可對原核和真核細胞基因組中的基因進行缺失、插入、和替換,且具有簡單、快速和有效的顯著的優(yōu)勢。文獻報道的能夠進行基因編輯的方法主要包括2類II型(CRISPR/Cas9)和V型(Cpfl/Cas12a),尤以化膿鏈球菌中的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。但該系統(tǒng)也具有其局限性,如:脫靶和生物相容性等。I型CRISPR-Cas系統(tǒng)是自然界中最常見的類型,該系統(tǒng)中的Cas3在降解DNA時通常是逐步降解而不是直接產(chǎn)生雙鏈斷裂,這也可能是為什么I型CRISPR-Cas系統(tǒng)是自然界中最常見的原因。然而,迄今為止,除本實驗室外,源自I型CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯工具未見報道。本實驗室從化工制藥廠的活性污泥中分離得到一株能夠以甾體化合物為唯一碳源進行生長的放線菌,我們將其命名為:維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14),該菌株的全基因組測序分析發(fā)現(xiàn):基因組上存在一個I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)。幸運的是:本實驗室前期基于該系統(tǒng)的Cascade和單一的SviCas3已在該菌株自身、大腸桿菌和釀酒酵母中實現(xiàn)了基因編輯。本論文旨在研究SviCas3與谷氨酸棒狀桿菌間的生物相容性,進而開發(fā)基于該菌株的基因編輯工具。實驗中,我們構(gòu)建了 2個蛋白表達質(zhì)粒(pEC-XK99E-cas753;pEC-XK99E-cas3中起始密碼子為ATG)和3個基因編輯質(zhì)粒(pXMJ19-t/g-△ldh;pXMJ1 9-t/g-△ldh::egfp;pXMJ19-t/g-△ldh::cat),并通過兩步電轉(zhuǎn)化將蛋白表達質(zhì)粒和基因編輯質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)感受中。驗證結(jié)果表明:(1)含有直接來源于維吉尼亞鏈霉菌IBL14染色體中基因cas7、cas5和cas3的蛋白表達質(zhì)粒pEC-XK99E-cas753結(jié)合基因編輯質(zhì)�？沙晒Φ膶劝彼岚魻顥U菌進行基因組編輯(乳酸脫氫酶基因內(nèi)部敲除了615 bp)。(2)僅含直接來源于維吉尼亞鏈霉菌IBL14染色體中單一cas3基因的蛋白表達質(zhì)粒pEC-XK99E-cas3結(jié)合基因編輯質(zhì)粒也能成功的對谷氨酸棒狀桿菌進行基因組編輯(成功的將egfp、cat基因插入到乳酸脫氫酶內(nèi)部)。(3)脫靶分析研究中未發(fā)現(xiàn)脫靶事件。(4)基于Cas9構(gòu)建的、作為對照試驗的基因編輯中沒有得到谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化子�？傊�:本論文(1)首次證實直接源于I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)中Svicas7-5-3基因的所開發(fā)的編輯工具能對該菌株進行基因組編輯,表明原核微生物中基因的堿基偏好要求不嚴;(2)首次證實了單一的未優(yōu)化的SviCas3可對谷氨酸棒狀桿菌的基因組進行編輯,表明在谷氨酸棒狀桿菌中SviCas3比SpCas9生物相容性好;(3)潛在打靶位點的測序分析中未發(fā)現(xiàn)有脫靶現(xiàn)象,支持別人已發(fā)表的Cas3不參與靶序列定位的研究觀點,暗藏著重要的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78
【圖文】：

谷氨酸棒狀桿菌中的成功應(yīng)用也避免了其他系統(tǒng)的干擾。逡逑乳酸脫氫酶基因總共編碼３１６個氨基酸殘基，該基因以ＡＴＧ為起始密碼子。逡逑由圖１－１可看出，在谷氨酸棒狀桿菌中乳酸脫氫酶可以催化乳酸的產(chǎn)生，大大增逡逑加了谷氨酸棒狀桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)中的產(chǎn)物。本篇論文就是將谷氨酸棒狀桿菌逡逑中的乳酸脫氫酶進行改造，將該基因完全敲除或在基因內(nèi)部插入特定基因序列來逡逑千擾該酶的表達，從而達到代謝產(chǎn)物的累積。逡逑葡萄糖逡逑個逡逑甘油醛－３－磷酸邐乳酸逡逑個邐Ａ逡逑磷酸甘油邋ｋ￣￣邋ＮＡＤ＋邐丨、逡逑醛脫氫酶逡逑、，邐＿Ｈ，Ｈ＋—＾乳酸脫逡逑１，３＿二磷酸甘油酸邐氫酶逡逑個逡逑Ｖ邐Ｖ逡逑３－磷酸甘油酸邋＜—邐一丙酮酸逡逑圖１－１靶基因代謝圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｃ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ逡逑１．２邋ＣＲＩＳＰＲ＿Ｃａｓ邋系統(tǒng)逡逑世界上存在很多種類的微生物，它們在繁殖時會受到噬菌體的侵染，噬菌體將逡逑細菌作為自己的宿主，在菌體內(nèi)完成復(fù)制并且殺死細胞。所以，從細菌的角度來逡逑看

邐Ｃ２ｃ２邐：？ｊ邋Ｃａｓｌ邋：邋Ｃａｓ２逡逑圖１－２邋ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)的分類與結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ邋ｓｙｓｔｅｍｓ邋（ＬＳ：邋ｌａｒｇｅ逡逑ｓｕｂｕｎｉｔ；ＳＳ：邋ｓｍａｌｌ邋ｓｕｂｕｎｉｔ；邋Ａ邋ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｓｍａｌｌ邋ｓｕｂｕｎｉｔ邋ｔｈａｔ邋ｃａｎ邋ｂｅ邋ｆｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ａ邋ｌａｒｇｅ邋ｓｕｂｕｎｉｔ逡逑ｏｆ邋ｓｅｖｅｒａｌ邋ｔｙｐｅ邋Ｉ邋ｓｕｂｔｙｐｅｓ邋ｉｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ｂｙ邋ａｎ邋ａｓｔｅｒｉｓｋ；邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ邋ｏｐｔｉｏｎａｌ逡逑ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ邋ａｒｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄａｓｈｅｄ邋ｏｕｔｌｉｎｅｓ：邋Ｔｈｅ邋ｑｕｅｓｔｉｏｎ邋ｍａｒｋ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈｅ逡逑ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ邋ｕｎｋｎｏｗｎ邋ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．）逡逑１．３邋１類Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)的干擾機制逡逑Ｉ型系統(tǒng)由于ｃｍ基因的數(shù)量和排列不同又被分為六種不同的亞型［２３］。每個逡逑亞型都有不同，例如Ｉ－Ａ亞型的由１２個ｃｏｓ基因組成，而銅綠假單胞菌中的１－Ｆ逡逑亞型僅含有６個ｃｍ基因。盡管每個亞型存在差異，但所有Ｉ型系統(tǒng)都編碼一種逡逑標志性的Ｃａｓ３蛋白以及普遍保守的Ｃａｓｌ蛋白｜２４邋２５］。盡管Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ陣列中的逡逑重復(fù)長度和序列在不同亞型之間是變化的，但重復(fù)內(nèi)的核苷酸序列是部分回文的逡逑（除了亞型丨－Ａ）。在Ｉ型系統(tǒng)中，重復(fù)陣列被轉(zhuǎn)錄成前體ｃｒＲＮＡ邋（ｐｒｅｃｒＲＮＡ），逡逑其中重復(fù)的回文序列形成發(fā)夾

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫香芹;;關(guān)于《谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵》小專題的復(fù)習(xí)[J];內(nèi)蒙古教育;2008年20期

2 褚志義,史濟平,鈕君健,胡英杰;前體和相關(guān)物對L-脯氨酸生物合成的影響[J];上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1988年01期

3 毛紹麟;通過谷氨酸棒狀桿菌由α-酮異已酸生產(chǎn)L-亮氨酸的微生物生產(chǎn)法[J];氨基酸雜志;1988年01期

4 Kazuo YAMAGUCHI ,黃騰華;關(guān)于谷氨酸棒狀桿菌變異株賴氨酸發(fā)酵~(13)C核磁共振的研究[J];氨基酸雜志;1988年04期

5 于元杰;谷氨酸棒狀桿菌質(zhì)粒的提取[J];山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1986年04期

6 雷呈宏，包雅芳，鄧家祺;谷氨酸棒狀桿菌尿素傳感器的研究[J];生物化學(xué)與生物物理進展;1995年06期

7 徐碩;盧文玉;;谷氨酸棒狀桿菌異源合成萜類化合物的研究進展[J];中國生物工程雜志;2019年06期

8 王婷;蔡檸勻;張德志;趙桂紅;徐慶陽;陳寧;;高產(chǎn)L-精氨酸谷氨酸棒狀桿菌的構(gòu)建[J];中國釀造;2019年05期

9 吳明;;溫度敏感型突變細菌生產(chǎn)L-谷氨酸[J];微生物學(xué)雜志;1985年02期

10 張海靈;李顏顏;王小元;;代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌合成及分泌途徑生產(chǎn)L-纈氨酸[J];生物工程學(xué)報;2018年10期

相關(guān)會議論文 前1條

1 蔡聰;梁春杰;朱江;何婷;劉買利;岳霞麗;楊運煌;;谷氨酸棒狀桿菌蛋白CGL2373的液體核磁結(jié)構(gòu)與功能研究[A];2018第二十屆全國波譜學(xué)學(xué)術(shù)年會會議論文摘要集[C];2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 張海靈;系統(tǒng)代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-纈氨酸[D];江南大學(xué);2018年

2 陳璨;谷氨酸棒狀桿菌對芳香族化合物耐受機制研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

3 孫楊;谷氨酸棒狀桿菌表達系統(tǒng)能量利用相關(guān)基因的挖掘和應(yīng)用[D];江南大學(xué);2018年

4 仝佳;產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌的發(fā)現(xiàn)、生物學(xué)特性及應(yīng)用性研究[D];江蘇大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 夏婷婷;I-B-Svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的基因編輯[D];安徽大學(xué);2019年

2 汪定奇;代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-蘋果酸的研究[D];武漢科技大學(xué);2019年

3 徐燕;谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032基因敲除和重組工程介導(dǎo)的點突變方法的探索[D];南京師范大學(xué);2018年

4 劉川;谷氨酸棒狀桿菌半胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的鑒定與特性研究以及半胱氨酸單細胞生物傳感器的構(gòu)建與應(yīng)用[D];天津科技大學(xué);2018年

5 敖婉欽;谷氨酸棒狀桿菌ATCC 14067中阻遏蛋白ArgR的克隆表達及生物學(xué)功能的初步分析[D];華南理工大學(xué);2018年

6 趙建勛;代謝工程改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-異亮氨酸[D];江南大學(xué);2015年

7 蔣新英;谷氨酸棒狀桿菌菌渣中胞壁酸的提取、純化及檢測[D];山東師范大學(xué);2015年

8 梅婕;谷氨酸棒狀桿菌S9114基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及能量代謝基因amn生理功能的解析[D];江南大學(xué);2015年

9 胡瑾瑜;谷氨酸棒狀桿菌基因敲除和表達系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用[D];江南大學(xué);2015年

10 曲茂華;海藻糖合酶生產(chǎn)菌株優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)分析[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2715909