芽孢桿菌CDJYB來源角蛋白酶基因克

發(fā)布時間：2020-06-12 12:42

【摘要】：角蛋白主要存在于動物的毛發(fā)、鱗片、羽毛、蹄、角等部位,由于其分子間富含二硫鍵以及疏水氨基酸,角蛋白往往難以降解,角蛋白酶可以在較為溫和的條件下高效降解角蛋白,使角蛋白得以被綠色環(huán)保的利用。角蛋白酶的作用底物廣范,在食品、藥品、清潔及皮毛加工等領(lǐng)域都有著應(yīng)用價值。本文利用多序列比對和分子克隆的方法,篩選出了一株芽孢桿菌CDJYB的角蛋白酶(Keratinase)基因,并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-Ker,經(jīng)誘導(dǎo)純化得到角蛋白酶,并探究了其酶學(xué)性質(zhì)及其在降解羽毛粉和羽毛中的應(yīng)用。具體研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1.利用多序列比對,設(shè)計引物,克隆得到未知芽孢桿菌CDJYB的角蛋白酶基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Ker,在Escherichia coli BL21菌株中重組表達(dá)角蛋白酶。在最佳誘導(dǎo)溫度20℃時,粗酶液中角蛋白酶酶活為389.7 U/mL。2.采用單因素法測定了重組角蛋白酶的最適反應(yīng)pH為10、最適反應(yīng)溫度為50℃,該酶熱穩(wěn)定較差,在50℃及以上孵育一小時后酶活損失超過80%。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Co~(2+)、Ba~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(3+)等金屬離子對角蛋白酶有著促進(jìn)作用,其中Cu~(2+)和Co~(2+)對重組酶的促進(jìn)作用尤其明顯。以可溶性角蛋白為底物時,還原劑DTT(DL-Dithiothreitol)和GSH(Glutathione)能部分抑制角蛋白酶活性,表面活性劑也能抑制重組酶,其中SDS(Sodium dodecyl sulfate)的抑制效果超過70%,重組酶被低濃度PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride,0.01%,w/v,mg/mL)強(qiáng)烈抑制,表明該酶是一種典型的絲氨酸蛋白酶,該酶對于磺化角蛋白的動力學(xué)參數(shù)V_(max)和K_m分別為62.5μg/(mL·min)和19.56 mg/mL。3.通過重組角蛋白酶降解羽毛粉和羽毛的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn):在角蛋白酶的作用下,羽毛粉(部分二硫鍵及其他化學(xué)鍵被破壞)在反應(yīng)6 h時后,酪氨酸釋放量為9.74 mg/g羽毛粉,達(dá)到酸法水解效果的39.4%;羽毛降解過程中DTT起著重要的作用,當(dāng)反應(yīng)中DTT濃度達(dá)到0.25%(w/v)時,其對角蛋白酶降解羽毛的促進(jìn)效果達(dá)到最大(降解產(chǎn)物OD_(280)為0.37),降解效果為不含DTT組(降解產(chǎn)物OD_(280)為0.019)的19.5倍;其次使用脂肪酶和蒸煮預(yù)處理羽毛后,都能夠加快角蛋白降解羽毛的速度,其中蒸煮法處理后效果顯著,但是脂肪酶和蒸煮法混合處理的效果卻沒有好于單一蒸煮法。電鏡掃描圖片顯示脂肪酶和蒸煮法預(yù)處理過后羽毛表面都變得更加粗糙,但經(jīng)過蒸煮后的羽毛表面顯得更加干燥蓬松。
【圖文】：

角蛋白酶,氨基酸序列

并使用粉狀角蛋白作為培養(yǎng)基中的唯一碳氮源，能夠篩選產(chǎn)角蛋白酶的微生物，并挑選水解圈與菌落直徑比值較大的菌落進(jìn)行發(fā)酵測試，獲得其中高產(chǎn)角蛋白酶的菌株。蔣彪等[17]通過這種篩選手段獲得了一株高產(chǎn)角蛋白酶的菌株Bacillus sp.。1.1.2 角蛋白酶的分類按照蛋白酶活性中心分類[18]，角蛋白酶可分為三類，，分別為：絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶。其中絲氨酸蛋白酶類的角蛋白酶數(shù)量最多，應(yīng)用也最為廣，主要產(chǎn)自細(xì)菌，蛋白多序列比對發(fā)現(xiàn)這些微生物絲氨酸蛋白酶在多個區(qū)域高度保守，三聯(lián)催化體 Asp、His、Ser 分別存在這些保守區(qū)域中，對于角蛋白的水解起到重要作用。金屬蛋白酶類的角蛋白酶在細(xì)菌、放線菌和真菌中都有報道，其活性中心含有 Zn2+等二價金屬，對于其催化功能行使重要作用。而一些角蛋白酶同時屬于絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，同時擁有以上兩類酶的性質(zhì)。天冬氨酸蛋白酶類的角蛋白酶目前只在人體腐生真菌 Candida albicans 中有發(fā)現(xiàn)，活性中心含天冬氨酸，這種蛋白酶是 Candida albicans 感染人體皮膚的作用因子[13-14]。

質(zhì)粒圖譜