【摘要】：植物在生長發(fā)育中經(jīng)常受到干旱脅迫的影響,加強(qiáng)植物耐旱機(jī)理的研究對提高植物的抗逆性和農(nóng)作物的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)具有重要意義。干旱脅迫下植物體內(nèi)ABA水平上升,進(jìn)而提高了植物抗逆性。F-box蛋白作為SCF型E3連接酶的關(guān)鍵亞基,在植物逆境耐性中具有重要功能,但小麥F-box蛋白與ABA調(diào)控的逆境耐性之間的關(guān)系尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期克隆了小麥F-box蛋白基因TaFBA1。研究發(fā)現(xiàn),TaFBA1過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性,并且過表達(dá)TaFBA1煙草的氣孔開度大,意味著TaFBA1在ABA調(diào)控的氣孔關(guān)閉中起負(fù)調(diào)控作用。本文研究了TaFBA1在ABA介導(dǎo)的植物干旱耐性及氣孔運(yùn)動(dòng)中的作用,并分析了其分子與生理機(jī)制。主要結(jié)果如下:(1)用基因組PCR和熒光定量PCR對TaFBA1過表達(dá)擬南芥、突變體和TaFBA1回補(bǔ)擬南芥進(jìn)行篩選。選取過表達(dá)株系OE4、OE5、OE6,突變體atfbw2-4、atfbw2-5、atfbw2-6和回補(bǔ)株系R-4、R-5、R-6作為實(shí)驗(yàn)材料。(2)用甘露醇模擬干旱脅迫對各株系進(jìn)行處理,同時(shí)添加ABA合成抑制劑Na_6WO_4,觀察統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)、子葉轉(zhuǎn)綠和幼根生長。結(jié)果顯示,正常條件下各株系的這些指標(biāo)無明顯差異;干旱抑制了所有株系的種子萌發(fā)、子葉轉(zhuǎn)綠和根系生長,但對過表達(dá)株系的抑制小于WT,對突變體的抑制大于WT;突變體中回補(bǔ)TaFBA1后,其干旱耐性明顯提高。抑制ABA合成后,干旱處理對所有植株的抑制效應(yīng)均有減輕,但沒有改變各株系之間的差異。這些結(jié)果暗示TaFBA1可能沒有參與ABA的合成。ABA含量檢測的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。(3)對各株系的成苗進(jìn)行自然干旱處理,檢測植株生長和葉片光合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干旱處理對成苗植株的影響與幼苗基本一致。正常條件下過表達(dá)和突變體株系的光合能力,包括氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(E)、凈光合速率(Pn)、細(xì)胞間CO_2濃度(Ci)都無明顯差異。干旱處理后,TaFBA1過表達(dá)株系的Gs、E、Pn都高于WT,突變體則反之;Ci無明顯差異。結(jié)果表明TaFBA1過表達(dá)提高了擬南芥的光合能力。(4)用ABA處理各株系發(fā)現(xiàn),過表達(dá)株系的種子萌發(fā)率和子葉變綠程度高、幼根伸長快、成苗長勢好;突變體植株則反之;突變體回補(bǔ)TaFBA1能夠降低突變體對ABA的敏感性。ABA處理?xiàng)l件下,TaFBA1過表達(dá)株系的光合能力強(qiáng)于WT,更強(qiáng)于突變體。這些結(jié)果說明TaFBA1過表達(dá)減輕了ABA處理對擬南芥植株的抑制效應(yīng)。(5)特別值得注意的是,干旱和ABA處理?xiàng)l件下,TaFBA1過表達(dá)植株有較高的Gs。過表達(dá)植株的氣孔關(guān)閉對ABA反應(yīng)比較慢,突變體的氣孔關(guān)閉對ABA反應(yīng)比較快。說明過表達(dá)TaFBA1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的氣孔關(guān)閉對ABA敏感性降低。(6)為了進(jìn)一步探究TaFBA1調(diào)控ABA信號通路的分子機(jī)制,我們檢測了ABA信號相關(guān)基因的表達(dá),包括ABA信號響應(yīng)基因和ABA合成相關(guān)基因。結(jié)果表明TaFBA1可調(diào)控ABA信號響應(yīng)基因表達(dá),但對ABA合成相關(guān)基因影響不大。氣孔運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因在過表達(dá)植株中均下調(diào)。這說明TaFBA1可能通過調(diào)控ABA響應(yīng)和氣孔運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而參與氣孔開關(guān)的調(diào)節(jié)。(7)以TaFBA1為誘餌,通過酵母雙雜實(shí)驗(yàn)獲得了兩個(gè)與TaFBA1互作的蛋白,ABA受體RCAR1和轉(zhuǎn)錄因子ABI5。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)顯示TaFBA1與RCAR1能夠相互作用,互作位置可能在細(xì)胞膜上。(8)從生理生化水平分析了各株系的抗氧化能力。結(jié)果表明,干旱和ABA條件下,TaFBA1過表達(dá)株系中H_2O_2含量、O_2~·ˉ產(chǎn)生速率以及MDA含量均低于WT,突變體則反之,回補(bǔ)株系均低于突變體。說明過表達(dá)TaFBA1增強(qiáng)了ABA和干旱處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化能力。這可能是TaFBA1提高擬南芥耐旱性的重要原因。綜上所述,小麥TaFBA1正向調(diào)節(jié)植物耐旱性,但與ABA生物合成無關(guān)。TaFBA1可能通過與RCAR1和ABI5相互作用,調(diào)控ABA信號通路相關(guān)的基因表達(dá),進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥對ABA的敏感性。增加抗氧化能力和減少活性氧積累可能是TaFBA1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株耐旱性提高的重要機(jī)制。
【圖文】：

小麥 F-box 蛋白基因 TaFBA1 在 ABA介導(dǎo)的植物干旱耐性中的功能 E1 激活，利用保守的 E1 催化半胱氨酸形成 E1-泛素(E1-Ub)與 E2 相互作用，，活化的泛素被轉(zhuǎn)移到 E2 的活性位點(diǎn)半胱氨-泛素(E2-Ub)中間體。泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白是由 E3 促進(jìn)的，E作用，然后將泛素轉(zhuǎn)移至底物的最佳結(jié)合位點(diǎn)，隨后啟動(dòng) Ub 素標(biāo)記過的底物蛋白，它所要面臨的就是被 26S 蛋白酶體識基酸重新進(jìn)入代謝途徑。泛素化途徑的特異性主要受底物募集因此，E3 連接酶控制著眾多的細(xì)胞過程，在整個(gè)泛素/26S 蛋重要的作用。

重復(fù)序列）結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)、WD40（Trp-Asp重復(fù)序列）結(jié)構(gòu)域、FBD結(jié)構(gòu)域、ARM結(jié)構(gòu)域、Kelch結(jié)構(gòu)域以及最新發(fā)現(xiàn)的CRFA結(jié)構(gòu)域、CRFB結(jié)構(gòu)域、CRFC結(jié)構(gòu)域等（如圖1-3）。圖 1-3 擬南芥中 F-box 蛋白 C 端互作結(jié)構(gòu)域模式圖（Gagne et al., 2001）Fig. 1-3 Model of F-box c-terminal Binding Protein Domain in Arabidopsis（Gagne et al., 2001）
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q945.78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2709697