【摘要】：植物在生長發(fā)育中經常受到干旱脅迫的影響,加強植物耐旱機理的研究對提高植物的抗逆性和農作物的穩(wěn)產、高產、優(yōu)質具有重要意義。干旱脅迫下植物體內ABA水平上升,進而提高了植物抗逆性。F-box蛋白作為SCF型E3連接酶的關鍵亞基,在植物逆境耐性中具有重要功能,但小麥F-box蛋白與ABA調控的逆境耐性之間的關系尚不清楚。實驗室前期克隆了小麥F-box蛋白基因TaFBA1。研究發(fā)現(xiàn),TaFBA1過表達提高了轉基因煙草的耐旱性,并且過表達TaFBA1煙草的氣孔開度大,意味著TaFBA1在ABA調控的氣孔關閉中起負調控作用。本文研究了TaFBA1在ABA介導的植物干旱耐性及氣孔運動中的作用,并分析了其分子與生理機制。主要結果如下:(1)用基因組PCR和熒光定量PCR對TaFBA1過表達擬南芥、突變體和TaFBA1回補擬南芥進行篩選。選取過表達株系OE4、OE5、OE6,突變體atfbw2-4、atfbw2-5、atfbw2-6和回補株系R-4、R-5、R-6作為實驗材料。(2)用甘露醇模擬干旱脅迫對各株系進行處理,同時添加ABA合成抑制劑Na_6WO_4,觀察統(tǒng)計種子萌發(fā)、子葉轉綠和幼根生長。結果顯示,正常條件下各株系的這些指標無明顯差異;干旱抑制了所有株系的種子萌發(fā)、子葉轉綠和根系生長,但對過表達株系的抑制小于WT,對突變體的抑制大于WT;突變體中回補TaFBA1后,其干旱耐性明顯提高。抑制ABA合成后,干旱處理對所有植株的抑制效應均有減輕,但沒有改變各株系之間的差異。這些結果暗示TaFBA1可能沒有參與ABA的合成。ABA含量檢測的結果也證明了這一點。(3)對各株系的成苗進行自然干旱處理,檢測植株生長和葉片光合能力。結果發(fā)現(xiàn),干旱處理對成苗植株的影響與幼苗基本一致。正常條件下過表達和突變體株系的光合能力,包括氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(E)、凈光合速率(Pn)、細胞間CO_2濃度(Ci)都無明顯差異。干旱處理后,TaFBA1過表達株系的Gs、E、Pn都高于WT,突變體則反之;Ci無明顯差異。結果表明TaFBA1過表達提高了擬南芥的光合能力。(4)用ABA處理各株系發(fā)現(xiàn),過表達株系的種子萌發(fā)率和子葉變綠程度高、幼根伸長快、成苗長勢好;突變體植株則反之;突變體回補TaFBA1能夠降低突變體對ABA的敏感性。ABA處理條件下,TaFBA1過表達株系的光合能力強于WT,更強于突變體。這些結果說明TaFBA1過表達減輕了ABA處理對擬南芥植株的抑制效應。(5)特別值得注意的是,干旱和ABA處理條件下,TaFBA1過表達植株有較高的Gs。過表達植株的氣孔關閉對ABA反應比較慢,突變體的氣孔關閉對ABA反應比較快。說明過表達TaFBA1導致轉基因植株的氣孔關閉對ABA敏感性降低。(6)為了進一步探究TaFBA1調控ABA信號通路的分子機制,我們檢測了ABA信號相關基因的表達,包括ABA信號響應基因和ABA合成相關基因。結果表明TaFBA1可調控ABA信號響應基因表達,但對ABA合成相關基因影響不大。氣孔運動相關基因在過表達植株中均下調。這說明TaFBA1可能通過調控ABA響應和氣孔運動相關基因的表達,進而參與氣孔開關的調節(jié)。(7)以TaFBA1為誘餌,通過酵母雙雜實驗獲得了兩個與TaFBA1互作的蛋白,ABA受體RCAR1和轉錄因子ABI5。雙分子熒光互補實驗(BiFC)顯示TaFBA1與RCAR1能夠相互作用,互作位置可能在細胞膜上。(8)從生理生化水平分析了各株系的抗氧化能力。結果表明,干旱和ABA條件下,TaFBA1過表達株系中H_2O_2含量、O_2~·ˉ產生速率以及MDA含量均低于WT,突變體則反之,回補株系均低于突變體。說明過表達TaFBA1增強了ABA和干旱處理條件下轉基因擬南芥的抗氧化能力。這可能是TaFBA1提高擬南芥耐旱性的重要原因。綜上所述,小麥TaFBA1正向調節(jié)植物耐旱性,但與ABA生物合成無關。TaFBA1可能通過與RCAR1和ABI5相互作用,調控ABA信號通路相關的基因表達,進而負調節(jié)擬南芥對ABA的敏感性。增加抗氧化能力和減少活性氧積累可能是TaFBA1過表達轉基因植株耐旱性提高的重要機制。
【圖文】：

小麥 F-box 蛋白基因 TaFBA1 在 ABA介導的植物干旱耐性中的功能 E1 激活，利用保守的 E1 催化半胱氨酸形成 E1-泛素(E1-Ub)與 E2 相互作用，，活化的泛素被轉移到 E2 的活性位點半胱氨-泛素(E2-Ub)中間體。泛素轉移到靶蛋白是由 E3 促進的，E作用，然后將泛素轉移至底物的最佳結合位點，隨后啟動 Ub 素標記過的底物蛋白，它所要面臨的就是被 26S 蛋白酶體識基酸重新進入代謝途徑。泛素化途徑的特異性主要受底物募集因此，E3 連接酶控制著眾多的細胞過程，在整個泛素/26S 蛋重要的作用。

重復序列）結構域、鋅指結構、WD40（Trp-Asp重復序列）結構域、FBD結構域、ARM結構域、Kelch結構域以及最新發(fā)現(xiàn)的CRFA結構域、CRFB結構域、CRFC結構域等（如圖1-3）。圖 1-3 擬南芥中 F-box 蛋白 C 端互作結構域模式圖（Gagne et al., 2001）Fig. 1-3 Model of F-box c-terminal Binding Protein Domain in Arabidopsis（Gagne et al., 2001）
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q945.78

【參考文獻】

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本文編號：2709697