【摘要】：泛素(Ub)-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)降解細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)。在UPS系統(tǒng)中,泛素化修飾是泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)以及泛素連接酶(E3)參與介導(dǎo)的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)。去泛素酶(Deubiquitylases,DUBs)調(diào)節(jié)泛素化修飾,人體內(nèi)大約有100多種具有活性的DUBs,并且許多與人類(lèi)疾病有關(guān),如癌癥和神經(jīng)退行性疾病。其中,卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域(OTU)家族是重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)因子。相比于其他去泛素化酶亞家族成員,OTU亞家族成員不同于其他去泛素化酶亞家族成員的獨(dú)特之處是OTU亞家族大部分成員都具有很強(qiáng)的泛素鏈識(shí)別特異性。例如,OTUD7B通過(guò)去泛素化TRAF3調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo),OTUB1抑制非經(jīng)典的依賴(lài)泛素的DNA損傷,OTULIN可以預(yù)防人和小鼠中與TNF相關(guān)的全身性炎癥。目前人源OTU家族共發(fā)現(xiàn)16個(gè)具有去泛素化酶催化活性的成員,主要可分為Otubains、A20-like OTUs和OTUDs和OTULIN四個(gè)亞家族,該家族成員主要通過(guò)高度保守的OTU結(jié)構(gòu)域行使其去泛素化酶的催化活性,且該家族成員對(duì)底物的去泛素化修飾具有鏈型特異性。其中去泛素化酶OTUB2(OTU Deubiquitinase,Ubiquitin Aldehyde Binding 2)編碼234個(gè)氨基酸,分子量為28KD,在Otubain亞家族中具有很高的同源性,與其它DUB類(lèi)似其具有典型的半胱氨酸酶活中心,催化核心結(jié)構(gòu)域?yàn)镃ys51,His224,Asn226。已知在2014年的一篇文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)OTUB2參與調(diào)節(jié)RAD6-RAD18介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù),在細(xì)胞內(nèi)敲除OTUB2后,DNA發(fā)生損傷時(shí)能夠快速募集53BP1和RAP80到達(dá)DNA損傷位點(diǎn)完成DNA損傷早期的非同源重組修復(fù)。OTUB2還能參與其他非典型的DNA損傷修復(fù)途徑,但是其機(jī)制尚不清楚。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferation Cell Nuclear Antigen,PCNA)是1978年在SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)患者的血清中由Miyachi等首先發(fā)現(xiàn)并命名的,且發(fā)現(xiàn)其在增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。PCNA是細(xì)胞增殖的分子標(biāo)記物,其蛋白水平隨著細(xì)胞周期變化,在G1期和S期蛋白水平達(dá)到峰值。PCNA作為一種腫瘤標(biāo)志物能夠參與翻譯后的信號(hào)傳導(dǎo),并且受多種翻譯后修飾。在過(guò)去的十年里,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)PCNA具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。DNA損傷是復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA核苷酸序列永久性改變,并導(dǎo)致遺傳特征改變的現(xiàn)象。2002年Nature的一篇文獻(xiàn)中證明RAD6途徑是真核細(xì)胞中復(fù)制時(shí)DNA修復(fù)的核心,但是其機(jī)制及調(diào)控仍然知之甚少。該途徑的兩個(gè)至關(guān)重要的關(guān)鍵因子是泛素結(jié)合酶RAD6,MMS2-UBC13異二聚體,并且由RING指蛋白R(shí)AD18和RAD5招募到染色質(zhì)中。PCNA是DNA聚合酶的輔助蛋白,是參與DNA合成和修復(fù)的重要底物。PCNA通過(guò)RAD6和RAD18進(jìn)行單泛素化,通過(guò)Lys63泛素鏈的修飾完成多聚泛素化修飾,PCNA的多聚泛素化修飾在DNA損傷修復(fù)中的作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高效于PCNA的單泛素化修飾�？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)PCNA的K63型泛素化修飾在依賴(lài)RAD6的DNA損傷修復(fù)中至關(guān)重要。并且已知USP1能夠去除PCNA的單泛素化,而去除其多聚泛素化的DUB未知。到底是E3影響了泛素鏈從而影響DNA損傷修復(fù)還是DUB影響泛素鏈從而影響DNA損傷修復(fù)尚不清楚。由此激發(fā)了我們研究E3和DUB對(duì)DNA損傷修復(fù)的興趣。我們的研究發(fā)現(xiàn)OTUB2能夠通過(guò)去泛素化酶的作用調(diào)控PCNA。本文主要探討去泛素化酶OTUB2與增殖細(xì)胞核抗原PCNA的相互作用及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。為了研究PCNA與OTUB2之間存在的聯(lián)系以及對(duì)生命活動(dòng)的影響,我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。我們首先通過(guò)免疫共沉淀和免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)去泛素化酶OTUB2與PCNA具有相互作用。在He La細(xì)胞系內(nèi)敲低OTUB2發(fā)現(xiàn)OTUB2能夠影響PCNA的多聚泛素化修飾,結(jié)果表明OTUB2能夠去除PCNA的多聚泛素化修飾,在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)OTUB2和OTUB2-C51S作泛素化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OTUB2能夠去除PCNA的泛素化修飾而OTUB2-C51S酶活突變體沒(méi)有去除其泛素化修飾,因此OTUB2發(fā)揮去泛素化酶的作用需要依賴(lài)其半胱氨酸酶的活性,這說(shuō)明OTUB2能夠去除PCNA的多聚泛素化修飾并且依賴(lài)其酶活中心。過(guò)表達(dá)OTUB2后PCNA的表達(dá)沒(méi)有變化,說(shuō)明OTUB2并不影響PCNA的穩(wěn)定性。綜上所述,OTUB2與PCNA之間具有相互作用,且OTUB2能夠去除PCNA的多聚泛素化修飾,不影響PCNA的穩(wěn)定性。為研究DNA損傷修復(fù)過(guò)程中DUB的重要作用提供了新的方向。去泛素化酶與泛素酶在生命體內(nèi)共同參與眾多的生物學(xué)過(guò)程。其中去泛素化酶中的OTU亞家族成員的典型特征是其主要通過(guò)高度保守的OTU結(jié)構(gòu)域行使去泛素化酶的催化功能。其中,OTUD4作為其中一員,目前的研究很少。已知的研究發(fā)現(xiàn)科學(xué)家采用斑馬魚(yú)作為模式生物敲低斑馬魚(yú)胚胎中的Rnf216或Otud4,發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的眼、視頂蓋及小腦發(fā)育缺陷,提示OTUD4可能在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為研究OTUD4在動(dòng)物整體水平的功能,我和劉雯師姐一起共同合作,基于Loxp-Cre系統(tǒng)構(gòu)建OTUD4基因全身性敲除小鼠。應(yīng)用Loxp-Cre系統(tǒng)構(gòu)建去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠利用Loxp-Cre系統(tǒng)原理,將Otud4基因中的4號(hào)外顯子選為打靶序列,將兩個(gè)Lox P位點(diǎn)分別設(shè)在E4的兩端,經(jīng)打靶載體轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞、陽(yáng)性克隆篩選、囊胚注射等過(guò)程,得到嵌合體小鼠,再將嵌合體小鼠與C57BL/6小鼠交配進(jìn)行繁育,最終得到雜合子小鼠并進(jìn)行自交得到新生F1代小鼠。然后利用PCR進(jìn)行基因型鑒定,使用免疫印跡(WB)技術(shù)從蛋白水平檢測(cè)OTUD4在各組織器官中的表達(dá),以明確基因敲除小鼠是否構(gòu)建成功。對(duì)各基因型小鼠進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析明確其是否符合孟德?tīng)栠z傳定律,是否具有胚胎致死表型。解剖小鼠分析主要組織器官有無(wú)明顯發(fā)育異常,利用HE染色分析是否具有自發(fā)的病理改變。通過(guò)葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)分析基因敲除小鼠是否具有代謝異常等。基因型鑒定和WB檢測(cè)結(jié)果顯示Otud4基因敲除小鼠模型建立成功。雜合子小鼠自交后各基因型比例符合孟德?tīng)柖?提示Otud4基因敲除小鼠非胚胎致死。各組織器官大小無(wú)顯著性差異,HE染色并無(wú)異常,且Otud4基因敲除后不影響小鼠的血糖穩(wěn)態(tài)。應(yīng)用Loxp-Cre系統(tǒng)成功構(gòu)建了Otud4基因敲除小鼠,并且小鼠正常出生,無(wú)任何胚胎發(fā)育缺陷,各器官無(wú)顯著病理性變化,血糖代謝無(wú)異常。綜上所述,利用Loxp-Cre系統(tǒng)構(gòu)建成功了OTUD4小鼠,為進(jìn)一步研究OTUD4體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 泛素化修飾的級(jí)聯(lián)反應(yīng)圖 (Chen and Lu, 2015)泛素化酶的研究物體內(nèi)的蛋白質(zhì)處于動(dòng)態(tài)平衡之中，，少不了去泛素化酶的作用，泛素化酶兩者之間相互調(diào)節(jié)共同維護(hù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。去泛素化酶

Otud4-/-小鼠模型構(gòu)建流程圖
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q75

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 裴培;成翕悅;王蕾;林燁;王珊;張?chǎng)?;組蛋白的類(lèi)泛素化修飾與發(fā)育調(diào)控研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2016年35期

2 鄭慶偉;;呂東平研究組在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)植物泛素化途徑的重建[J];農(nóng)藥市場(chǎng)信息;2017年15期

3 劉文斌;;去泛素化酶研究進(jìn)展[J];武漢輕工大學(xué)學(xué)報(bào);2016年03期

4 艾永興;趙程程;鄭海南;吳山力;張玉靜;;病毒編碼的泛素化酶與去泛素化酶的研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

5 王春梅;李楠;;USP10通過(guò)去泛素化P53調(diào)控P53的定位和穩(wěn)定性[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2010年03期

6 周蕊,余澤華;泛素化途徑與細(xì)胞周期的關(guān)系[J];生命科學(xué);2003年03期

7 趙佳楠;陳嘉婧;楊世平;張子丁;;小鼠蛋白質(zhì)泛素化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)及分析[J];中國(guó)科技論文;2017年06期

8 劉石娟;秦宗燕;王雪;顏梅;張靜;梁超超;;植物去泛素化酶研究進(jìn)展[J];植物生理學(xué)報(bào);2016年08期

9 唐時(shí)s

本文編號(hào)：2705801