【摘要】：活細(xì)胞的細(xì)胞器和內(nèi)源性蛋白等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的可視化有利于研究其動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系,對(duì)生命科學(xué)研究具有重要意義。隨著活細(xì)胞熒光顯微技術(shù)的快速發(fā)展,活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)也在不斷發(fā)展。目前,常見的活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)主要有熒光蛋白、化學(xué)標(biāo)簽、有機(jī)小分子熒光探針、量子點(diǎn)和納米顆粒等。其中,熒光蛋白較大的尺寸會(huì)影響目的蛋白的生理功能并且出現(xiàn)過表達(dá)等問題,從而不利于活細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的可視化研究。量子點(diǎn)和納米顆粒由于細(xì)胞毒性未能解決,不是活細(xì)胞標(biāo)記的最佳選擇。化學(xué)標(biāo)簽技術(shù),如SNAP-tag/CLIP-tag技術(shù),其底物可以與不同的有機(jī)熒光染料共價(jià)結(jié)合;而有機(jī)小分子熒光探針也可以通過識(shí)別基團(tuán),如三苯基膦、多西他賽等,與不同的有機(jī)熒光染料共價(jià)結(jié)合,兩者都可以設(shè)計(jì)合成出一系列適用于活細(xì)胞標(biāo)記的有機(jī)熒光探針。然而,大多數(shù)商業(yè)有機(jī)熒光染料由于不透膜,而無法直接進(jìn)入活細(xì)胞,使得在活細(xì)胞標(biāo)記上應(yīng)用受到限制。基于以上問題,本文合成了一種透膜有機(jī)熒光染料和兩種不透膜有機(jī)熒光染料以及四種識(shí)別基團(tuán),通過將熒光染料與識(shí)別基團(tuán)共價(jià)結(jié)合,最后得到了可以標(biāo)記微管、微絲、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核的有機(jī)熒光探針;另外,利用商業(yè)有機(jī)熒光染料,合成了分別標(biāo)記線粒體和溶酶體的有機(jī)熒光探針,并且利用這些探針進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)利用簡(jiǎn)單的起始物合成了透膜有機(jī)熒光染料四甲基硅基羅丹明SiR,為了實(shí)現(xiàn)多通道成像,合成了兩種不透膜有機(jī)熒光染料TMR和5(6)-羧基Rho110。(2)利用簡(jiǎn)單的起始物合成了SNAP-tag的識(shí)別基團(tuán)BG及其衍生物CBG、SNAP-BHQ2和CLIP-tag的識(shí)別基團(tuán)BC,設(shè)計(jì)合成了一種靶向微管的識(shí)別基團(tuán)Docetaxel-C_6-NH_2,降低了微管探針設(shè)計(jì)合成難度,可以與商業(yè)有機(jī)熒光染料簡(jiǎn)單連接,構(gòu)成一系列微管探針。(3)利用上述的有機(jī)熒光染料和識(shí)別基團(tuán),首先合成了有機(jī)熒光探針Tubulin-SiR,首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床中人源血小板活細(xì)胞的微管特異性標(biāo)記;然后合成了有機(jī)熒光探針SNAP-SiR,分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、微絲的特異性標(biāo)記;之后合成了有機(jī)熒光探針CLIP-SiR,實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異性標(biāo)記;最后設(shè)計(jì)合成了一種新型改善熒光背景的有機(jī)熒光探針SNAP-Q-Rho110,用于活細(xì)胞成像測(cè)試。另外,基于商業(yè)有機(jī)熒光染料,設(shè)計(jì)合成了靶向標(biāo)記線粒體和溶酶體的有機(jī)熒光探針3P-FITC、3P-Cy3B和Morph-FITC,并將三種有機(jī)熒光探針應(yīng)用于活細(xì)胞標(biāo)記,其中Morph-FITC與商業(yè)溶酶體探針LysoTracker Red共定位實(shí)驗(yàn),展示了Morph-FITC對(duì)溶酶體優(yōu)異的特異性。
【圖文】：

圖 1-1 SNAP-tag 的標(biāo)記原理，摘自文獻(xiàn)[16]。Figure1-1 The labeling principle of SNAP-tag[16].著超分辨率顯微成像技術(shù)的顯著發(fā)展，在亞細(xì)胞水平觀SNAP-tag 可以與活細(xì)胞中目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，其合，形成一系列有機(jī)熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)Klein T 等[4]構(gòu)建 SNAP-H2B 蛋白，使其能在 COS7 活細(xì)P-TMR 有機(jī)熒光探針對(duì) SNAP-H2B 蛋白進(jìn)行標(biāo)記， H2B 蛋白的 dSTORM 超分辨率熒光顯微成像，，也預(yù)示熒光蛋白和熒光染料相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的超分辨率雙]證明了SNAP-tag技術(shù)可以應(yīng)用于活細(xì)胞單分子多色成納米藥物的底物與 SNAP-tag 蛋白靶向識(shí)別，使精準(zhǔn)治療dayachee E R 等[21]將具有靶向性的藥物與 SNAP-tag 技 CSPG4 的皮膚腫瘤細(xì)胞上的診斷和治療，展現(xiàn)了 SNA

可以通過對(duì)其底物連接的熒光分子進(jìn)行篩選、改造，得到特異性較高有機(jī)熒光探針，廣泛應(yīng)用于對(duì)活細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的可視化研究。alo-tag95 年，Pries F 等[36]發(fā)現(xiàn)了黃原桿菌(DhlA)的脫鹵酶可以使組氨酸發(fā)生二溴乙烷形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)構(gòu)。2008 年，Los G V 等[37]基于這個(gè)現(xiàn)有的現(xiàn)了一種新穎的蛋白特異性標(biāo)簽方法，通過對(duì)紫紅紅球菌的脫logenase, DhaA）進(jìn)行突變，將組氨酸改變成苯丙氨酸，使脫鹵生成的存在，得到一種可以與鹵代烷烴進(jìn)行特異性共價(jià)結(jié)合的蛋白標(biāo)簽，Hg 分子量為 33KDa，由 293 個(gè)氨基酸組成。如圖 1-3 所示，Halo-tag 標(biāo)先在色氨酸和天冬氨酸的催化條件下，脫鹵素酶活性位點(diǎn)的羧酸會(huì)與化反應(yīng)，脫出鹵素 Cl，由于已經(jīng)將脫鹵素酶中具有催化水解作用的組化作用的苯丙氨酸，所以不會(huì)進(jìn)一步反應(yīng)生成醇，而是以酯基形式，價(jià)結(jié)構(gòu)[38,39]。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q2-33

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本文編號(hào)：2701099