【摘要】：轉(zhuǎn)座子是存在于染色體上的一段可移動的DNA�；谝呀�(jīng)成熟的Mariner家族Himar1轉(zhuǎn)座子pMAR2×T7,我們設(shè)計(jì)并改造成滿足特定需求的轉(zhuǎn)座子pMKGR。pMKGR攜帶慶大霉素抗性標(biāo)簽和mCherry紅色熒光標(biāo)簽,也攜帶無啟動子的EGFP和卡那霉素閱讀框,識別TA堿基位點(diǎn)并且插入染色體。以殺魚愛德華氏菌(Edwardsiella piscicida)為模式菌,成功構(gòu)建了包含20,668個插入位點(diǎn)確定的突變株文庫。該文庫覆蓋殺魚愛德華氏菌全基因組(編碼3,599基因)中2,806個基因,覆蓋率為78.0%。根據(jù)文庫的分析數(shù)據(jù)和中性堿基模型,我們預(yù)測殺魚愛德華氏菌大約有464個必需基因。針對文庫不同的篩選目的,在文庫的基礎(chǔ)上構(gòu)建了 5個不同的子庫,利用5個子庫進(jìn)行了體內(nèi)外毒力相關(guān)基因的篩選。Tn-seq篩選結(jié)果顯示,殺魚愛德華氏菌毒力表達(dá)與其代謝狀態(tài)密切相關(guān),尤其是甘露糖代謝和脂肪酸代謝,相關(guān)基因的突變導(dǎo)致該菌的體內(nèi)存活能力顯著降低。對于甘露糖代謝,E.piscicida通過ManXYZ催化甘露糖生成甘露糖-6磷酸(Man-6P),經(jīng)ManA催化進(jìn)一步生成果糖-6磷酸(Fru-6P),參與糖酵解過程。我們發(fā)現(xiàn),甘露糖代謝產(chǎn)物Man-6P可以通過直接結(jié)合DeoR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ETAE_2071(EvrA),調(diào)控三型分泌系統(tǒng)(T3SS)以及六型分泌系統(tǒng)(T6SS)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),EvrAR141和EvrAR221是和Man-6P相互作用的關(guān)鍵氨基酸。突變這兩個氨基酸后,EvrA不能感受并結(jié)合甘露糖,進(jìn)而關(guān)閉esrB的表達(dá)。在考察脂肪酸和T3/T6SS表達(dá)之間關(guān)系時,我們發(fā)現(xiàn)E.piscicida體內(nèi)不飽和脂肪酸含量和T3SS顯著負(fù)相關(guān)(R2=0.981)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),游離長鏈單不飽和脂肪酸(UFA)可以直接與EsrC相互作用,使EsrC失去結(jié)合DNA的能力,最終關(guān)閉T3/T6SS的表達(dá)。通過對EsrC蛋白結(jié)構(gòu)的模擬分析,發(fā)現(xiàn)EsrC和UFA直接作用的關(guān)鍵氨基酸為EsrCR38。在E.piscicida感染宿主和成功定植過程中,UFA扮演了更為重要的角色。UFA不僅動態(tài)調(diào)控了殺魚愛德華氏菌T3/T6SS毒力系統(tǒng)的表達(dá),而且促進(jìn)了宿主細(xì)胞內(nèi)脂滴(Lipid droplet,LD)的大量形成,進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng),清除病原菌。在宿主細(xì)胞中,多余的脂肪酸主要以甘油三酯和膽固醇酯的形式儲存在LD細(xì)胞器中。細(xì)胞中LD的含量與不飽和脂肪酸含量線性相關(guān)。E.pisciciEa感染宿主細(xì)胞的過程顯著降低了宿主細(xì)胞中LD的含量,E.piscicida ΔT3SS感染過程卻顯著激活了宿主體內(nèi)SCD1表達(dá),促進(jìn)了LD形成。E.piscicida T3SS對宿主細(xì)胞中UFA/LD合成的抑制不依賴于T3SS針狀結(jié)構(gòu),而依賴于T3SS效應(yīng)物。UFA顯著抑制了EE.piscicida在HeLa細(xì)胞中定植,E.piscicida在SCD1-/-細(xì)胞中的定植水平顯著高于在野生型HeLa細(xì)胞中的定植水平。在E.piscicida感染斑馬魚過程中,外加油酸顯著提高了斑馬魚的存活率,SCD1-/-斑馬魚顯示出對E.piscicida更高的敏感性。UFA/LD既能抑制病原菌毒力表達(dá),又能激活宿主免疫響應(yīng),以抵抗和清除外來的病原菌。因此,UFA/LD在抵抗E.piscicida感染宿主方面發(fā)揮了重要作用。在自然界中,病原菌利用自身代謝物或者宿主體內(nèi)代謝物作為信號調(diào)控毒力表達(dá)是病原菌適應(yīng)復(fù)雜多變體內(nèi)外環(huán)境的一種重要策略。本課題利用轉(zhuǎn)座子插入突變文庫為工具,以E.pipscicida為模式菌,研究病原微生物代謝和毒力互作關(guān)系。本研究為水產(chǎn)病原防治和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供重要的指導(dǎo)。
【圖文】：

１．１．１殺魚愛德華氏菌概述逡逑愛德華氏菌（及屬于腸桿菌科，革蘭氏陰性菌，短桿狀，具有周生鞭毛［１］逡逑（圖１．１Ａ）。愛德華氏菌是一種重要的魚類致病菌，能對大菱鲆、鯰魚、鰻鱺和斑馬魚等逡逑２０多種淡水和海水魚類致病，引起出血性敗血癥，造成大量魚類死亡，嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)逡逑殖業(yè)［２－５］（圖１．１Ｂ，Ｃ）。最初于１９６２年，殺魚愛德華氏菌從日本鰻逡逑鱺中分離得到；１９６５年，Ｅｗｉｎｇ等將這一類細(xì)菌命名為遲緩愛德華氏菌（及／ｎｗＹｆｏＷ／ｆｌ逡逑ｔｏ油）［６，７］；邋２０１３年，Ａｂａｙｎｅｈ等對遲緩愛德華氏菌中的菌株重新分類，將來自人類排泄逡逑物與來自魚體的菌株區(qū)分開，組成新的種為殺魚愛德華氏菌（￡．／＾ｃｚ＿ｄｔ／ａ）［８］。２００６年，本逡逑課題組從山東煙臺患病大菱鲆中分離得到殺魚愛德華氏菌強(qiáng)毒株Ｅ邐辦ＥＩＢ２０２［２］。逡逑五．ｐＷｃ油可在１５？４２°Ｃ溫度范圍內(nèi)生長，適宜ｐＨ范圍５．５？９．０［２］。逡逑２０１４年，，本課題組通過多位點(diǎn)序列分型與分析技術(shù)（ＭＬＳＴ與ＭＬＳＡ）對愛德華氏菌逡逑菌屬重新進(jìn)行了生物學(xué)分類Ｐ

２頁邐華東理工大學(xué)博士學(xué)位論于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類健康有重要意義。逡逑１．１．２殺魚愛德華氏菌的主要毒力系統(tǒng)逡逑１．１．２．１三型分泌系統(tǒng)逡逑三型分泌系統(tǒng)（Ｔｙｐｅ邋ＩＩＩ邋ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ，邋Ｔ３ＳＳ）廣泛地編碼于革蘭氏陰性病原菌體內(nèi)是細(xì)菌向外界環(huán)境或者宿主細(xì)胞注射效應(yīng)蛋白的針筒狀復(fù)合結(jié)構(gòu)（圖１．２Ａ，Ｂ）。攜帶Ｔ３Ｓ的病原菌，主要包括沙門氏菌志賀氏菌0Ｓ７７／ｇｖ？／／ｏｓｐｐ．）、鼠疫耶森菌霍亂弧菌（附／／？0邋ｃ／ｗ／ｅｒａｅ）、百曰咳博德氏菌（ＳｏｒｆｉｆｅｅＺ／ａｐｅｎｔｏｓ／ｓ１）銅綠假單胞菌（Ｐｓｅｗｃ／ｏｍｏｍｗ邋ａｅｒｕｇ７＞７0５’ａ）。關(guān)于Ｔ３ＳＳ的起源一直存在爭論，但是目前遍認(rèn)為Ｔ３ＳＳ由鞭毛組裝元件進(jìn)化而來［Ｗ。在向胞外分泌鞭毛組裝的元件蛋白過程中鞭毛組裝所依賴的蛋白分泌機(jī)制和Ｔ３ＳＳ有很多共同之處［１５１邋（圖１．２Ｃ）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;S941.42

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本文編號：2701294