【摘要】：裂解性多糖單加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一類廣泛存在于真菌、細(xì)菌中的單銅氧化酶。當(dāng)外源電子供體及氧存在時(shí),LPMO活性中心可形成Cu-氧中間體,氧化斷裂纖維素或半纖維素。但是木質(zhì)素抗性屏障通常會(huì)限制酶與纖維素或半纖維素的結(jié)合,當(dāng)LPMO結(jié)合受阻時(shí),Cu-氧中間體則釋放出活性氧并產(chǎn)生與木質(zhì)素生物降解密切相關(guān)的H_2O_2。如果LPMO能夠通過產(chǎn)生H_2O_2或者其他途徑參與并促進(jìn)木質(zhì)素生物降解,將在木質(zhì)素的生物降解以及解除碳素循環(huán)的限制因素方面意義重大,然而目前對(duì)LPMO是否參與木質(zhì)素降解及其機(jī)制知之甚少。因此本論文針對(duì)LPMO是否參與木質(zhì)素的生物降解及其機(jī)制如何這一科學(xué)問題,基于功能基因組學(xué)研究了LPMO與木質(zhì)素降解修飾過氧化物酶(lignin-degrading and-modifying peroxidase,LDMPE)之間的可能關(guān)聯(lián)。在此基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示了以木質(zhì)素降解真菌—白腐菌為主的LPMO參與降解木質(zhì)素的途徑和機(jī)制。論文主要研究結(jié)論如下:(1)真菌、細(xì)菌LPMO和LDMPE之間共發(fā)生具有普遍性對(duì)71株木質(zhì)纖維素降解菌進(jìn)行功能基因組比較分析結(jié)果顯示:88.7%的基因組中都存在LPMO。基因組中的LPMO與木質(zhì)素降解修飾酶(lignin-degrading and-modifying enzyme,LDME)之間普遍存在共發(fā)生現(xiàn)象,且主要發(fā)生在LPMO和LDMPE之間。98.2%的真菌基因組中LPMO和LDME共發(fā)生,其中白腐菌基因組中的LPMO和LDPME之間的共發(fā)生性具有普遍性占83.9%。細(xì)菌基因組中LPMO和LDME之間的共發(fā)生性為46.7%,主要存在于細(xì)菌,尤其放線菌門為主的LPMO與關(guān)鍵LDMPE—染料脫色過氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase,DyP)之間。真菌和細(xì)菌基因組中的LPMO與LDMPE在數(shù)量上均具有較強(qiáng)相關(guān)性(r0.6),其中在具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的白腐菌(真菌)和放線菌門(細(xì)菌)中相關(guān)性最高。表明LPMO與LDMPE在基因組層面上存在關(guān)聯(lián),尤其是在木質(zhì)素降解能力最強(qiáng)的白腐菌中相關(guān)性最高,達(dá)到0.807,可能與木質(zhì)素降解相關(guān)。(2)揭示了白腐菌LPMO介導(dǎo)木質(zhì)素降解的不同途徑及機(jī)制異源表達(dá)獲得了來源于白腐真菌Pleurotus ostreatus BP3的且具有生物活性的PoLPMO9A,并且從其電子供體等方面明確了其反應(yīng)特征�；诖诉M(jìn)一步從體外驅(qū)動(dòng)的LDMPE反應(yīng)和增強(qiáng)醌-氫醌氧化還原循環(huán)所誘導(dǎo)的芬頓反應(yīng)途徑等2個(gè)方面研究了LPMO介導(dǎo)的木質(zhì)素降解新機(jī)制。結(jié)果表明,當(dāng)存在Ⅱ型過氧化物酶PsVP(真菌LDMPE)及相應(yīng)的還原劑時(shí),還原型LPMO產(chǎn)生的H_2O_2優(yōu)先被PsVP利用,驅(qū)動(dòng)PsVP實(shí)現(xiàn)單體、二聚體木質(zhì)素模型化合物和木質(zhì)素高分子的降解。堿木素和天然木質(zhì)素高分子被LPMO-PsVP體系降解后木質(zhì)素衍生物總相對(duì)豐度分別下降了17.1%和6.3%。另一方面,LPMO與漆酶等木質(zhì)素酶類似,可以氫醌為電子供體將其氧化為半醌自由基,同時(shí)產(chǎn)生H_2O_2并促進(jìn)Fe~(3+)還原參與并增強(qiáng)醌氧化還原循環(huán)誘導(dǎo)的芬頓反應(yīng),顯著促進(jìn)羥自由基(HO·)產(chǎn)生。LPMO介導(dǎo)的芬頓反應(yīng)機(jī)制是半醌驅(qū)動(dòng)的芬頓反應(yīng)機(jī)制。H_2O_2的產(chǎn)生和Fe~(3+)的還原與氫醌種類、氫醌的含量及LPMO的含量有關(guān)。在500?M 2,6-二甲氧基-1,4-對(duì)苯二酚(DBQH_2)條件下,HO·含量較無(wú)LPMO的氫醌氧化還原體系提高了2.77倍。由此揭示LPMO可作為輔助酶,通過驅(qū)動(dòng)LDMPE反應(yīng)和增強(qiáng)醌氧化還原循環(huán)誘導(dǎo)的芬頓反應(yīng)等2條途徑,參與木質(zhì)素的降解。(3)利用鏈霉菌驗(yàn)證了LPMO體內(nèi)外介導(dǎo)木質(zhì)素降解功能以Streptomyces coelicolor M145(ScM145)為對(duì)象,從體外和體內(nèi)兩個(gè)方面證實(shí)了LPMO參與了生物體對(duì)木質(zhì)素的降解�？寺『屯幢磉_(dá)了2條在木質(zhì)素基質(zhì)存在條件下相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)最顯著(3~11倍)的LPMO基因Sclpmo10B和Sclpmo10D,通過接合轉(zhuǎn)移獲得了同源過表達(dá)LPMO的重組鏈霉菌Sc M145-ΔLPMO10B(+)和ScM145-ΔLPMO10D(+)。體外實(shí)驗(yàn)表明鏈霉菌來源的LPMO也能夠通過驅(qū)動(dòng)LDMPE反應(yīng)和芬頓反應(yīng)途徑參與木質(zhì)素降解。體內(nèi)功能驗(yàn)證表明,較野生型鏈霉菌ScM145相比,過表達(dá)LPMO鏈霉菌ScM145-ΔLPMO10B(+)和ScM145-ΔLPMO10D(+)對(duì)木質(zhì)素的降解能力顯著增強(qiáng),降解木質(zhì)素9天后,木質(zhì)素衍生物總豐度分別下降25.4%和31.0%,較野生型ScM145分別增強(qiáng)了2.65和3.23倍,同時(shí)過表達(dá)菌株的鐵還原能力和木質(zhì)素解聚釋放的總酚含量也顯著提高。由此證實(shí)了來自于白腐菌等的LPMO在木質(zhì)素降解中可能發(fā)揮作用,且分屬于不同門中的實(shí)驗(yàn)菌株LPMO具有同樣的機(jī)制參與木質(zhì)素降解途徑。綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)并揭示了LPMO以不同的反應(yīng)途徑及機(jī)制介導(dǎo)白腐菌等的木質(zhì)素生物降解。相關(guān)研究結(jié)果不僅拓展LPMO的生物學(xué)功能,明晰了LPMO在木質(zhì)纖維素腐朽中的新作用,也為進(jìn)一步明晰木質(zhì)纖維素生物降解的機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文4（A）（B）圖1.1真菌和細(xì)菌LPMO活性位點(diǎn)[28]Figure1.1Coppercontainingactivesiteofbacterial(A)andfungal(B)LPMO.盡管不同LPMO在活性位點(diǎn)的構(gòu)象上存在顯著差異，但他們大都具有相似的3D結(jié)構(gòu)和催化特征：（1）具有一個(gè)較平坦的活性中心，可以與纖維素的結(jié)晶部分相互作用；（2）金屬依賴性，特別是對(duì)銅具有催化活性；銅離子容納在稱為組氨酸支架的結(jié)構(gòu)中，保守的組氨酸存在于C-和N-末端；（3）依賴外部電子供體來還原銅離子[29;32;33]。活性中心二價(jià)銅離子具有廣泛的奪取還原劑電子并傳遞電子的能力。1.1.2.2裂解性多糖單加氧酶催化機(jī)制裂解性多糖單加氧酶的多糖催化機(jī)制[34;35]，如圖1.2所示。由電子供體提供一個(gè)電子將LPMOCu（Ⅱ）還原成Cu（Ⅰ）是反應(yīng)的起始步驟。隨后還原型的LPMO活性位點(diǎn)Cu（Ⅰ）與O2反應(yīng)形成Cu（Ⅰ）-O中間體，經(jīng)過脫水后形成Cu（Ⅱ）-O-O復(fù)合物進(jìn)攻多糖底物，，經(jīng)過轉(zhuǎn)移第二個(gè)電子和2個(gè)質(zhì)子，使糖苷鍵斷裂，并將多糖底物氧化，產(chǎn)生寡糖和氧化型的寡糖。O2驅(qū)動(dòng)的LPMO催化機(jī)制完成整個(gè)催化循環(huán)過程一共需要2個(gè)電子和2個(gè)質(zhì)子，形成產(chǎn)物的量與還原劑的量具有化學(xué)計(jì)量相關(guān)性。整個(gè)裂解性多糖單加氧酶催化反應(yīng)的關(guān)鍵在于存在有效的電子供體作為還原劑將LPMO活性中心的Cu（Ⅱ）還原成Cu（Ⅰ），目前已報(bào)道多種不同類型的還原劑均能夠作為L(zhǎng)PMO的電子供體。

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文5圖1.2裂解性多糖單加氧酶催化機(jī)制[34]Figure1.2LPMOreactionpathways.1.1.3裂解性多糖單加氧酶電子供體及與氧化還原酶之間的相互作用還原劑/電子供體（類型和濃度）是LPMO催化功能的主要決定因素。LPMO催化反應(yīng)可以通過各種電子供體來啟動(dòng)[36]，來源廣泛，包括非酶來源的小分子還原劑，如抗壞血酸和幾種酚類，木質(zhì)素和木質(zhì)素片段和光驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)以及能夠提供還原當(dāng)量的酶，如纖維二糖脫氫酶。此外，一些真菌氧化還原酶與LPMO之間存在相互作用，氧化還原酶降解產(chǎn)物能夠作為L(zhǎng)PMO電子供體將其還原，如圖1.3所示。1.1.3.1非酶來源電子供體（1）小分子電子供體抗壞血酸是公認(rèn)的最常見的LPMO電子供體[10]。一些其他的小分子化合物或酚類，例如2,6-二甲氧基-1,4-對(duì)苯二酚（DBQH2）、半胱氨酸、沒食子酸等也可以作為有效電子供體還原LPMO[37]。Frommhagen等[38]共研究了34種電子供體，發(fā)現(xiàn)植物來源的類黃酮和木質(zhì)素來源的衍生物1,2-苯二醇或1,2,3-苯三醇能促進(jìn)的LPMO活性，而單酚和含硫化合物存在下對(duì)纖維素氧化存在低活性。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q55

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