【摘要】：第一部分 表達(dá)CTLA-4抗體的重組流感病毒構(gòu)建及篩選背景:原發(fā)性肝癌(HCC)是全世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤之一,世界范圍內(nèi)死亡率居第三位,而在亞洲其死亡率居第二位。盡管科學(xué)家們不斷探索研究治療腫瘤的方法,但由于腫瘤細(xì)胞增長迅速,易侵襲周圍組織等,就目前為止其治愈率并未顯著的提高。因此,尋找新的治療肝癌的方法一直是人類面臨的挑戰(zhàn)。越來越多的研究表明,溶瘤病毒可選擇性地靶向性癌細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯影響,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗-4(CTLA-4)可靶向T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)途徑,增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答,因此,研究表達(dá)CTLA-4抗體的溶瘤病毒對癌癥治療方面有重要作用。目的:拯救表達(dá)免疫檢查點muCTLA-4抗體的重組流感病毒,并對其進(jìn)行全面鑒定。方法:(1)在A/Puerto Rico/8/34(PR8)流感病毒的PB1上構(gòu)建muCTLA-4的抗體重鏈、PA上構(gòu)建muCTLA-4的抗體輕鏈,與流感病毒PR8的6個質(zhì)粒pHW191-PB2、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M、pHW198-NS共轉(zhuǎn)染COS-1、MDCK細(xì)胞,收集細(xì)胞上清,將其接種于SPF雞胚、超濾濃縮、純化等步驟獲得重組溶瘤流感病毒,命名為rFlu-muCTLA-4;(2)通過電鏡觀察重組溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的形態(tài)與大小分布、血凝試驗、EID_(50)、PCR等方法對rFlu-muCTLA-4進(jìn)行全面鑒定;(3)重組溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4經(jīng)純化、濃縮、離子交換后,利用ELISA實驗測定rFlu-muCTLA-4中anti-CTLA-4抗體的含量。結(jié)果:(1)經(jīng)透射電鏡觀察rFlu-muCTLA-4多數(shù)為球形,表面有棘突,其顆粒直徑約在80~120nm之間,表明重組溶瘤流感病毒rFlu-muCTLA-4的病毒形態(tài)和顆粒大小分布符合流感病毒典型特征;(2)收取陽性尿囊液,經(jīng)血凝檢測為陽性,rFlu-muCTLA-4的血凝效價為2~(9~10);rFlu-muCTLA-4的EID_(50)為10~(-8) EID_(50)/mL、重組溶瘤病毒rFlu-muCTLA-4的PB1、PA基因片段與預(yù)期大小一致。(3)分別收取接種重組病毒rFlu-muCTLA-4第2、3、4天的雞胚,經(jīng)蛋白純化,可檢測到anti-CTLA-4抗體。結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了一株表達(dá)免疫檢查點抑制劑muCTLA-4抗體的重組流感病毒,并完成對該病毒的初步鑒定,為下一步的體內(nèi)、外實驗提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。第二部分 表達(dá)CTLA-4抗體的重組流感病毒治療H22肝癌細(xì)胞的體內(nèi)、外實驗研究目的:評價構(gòu)建的重組溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4對小鼠H22肝癌的治療效果。方法:(1)體外實驗,采用MTS方法檢測溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4對H22細(xì)胞株的殺傷作用,并檢測r Flu-mu CTLA-4對H22細(xì)胞的毒性;(2)體內(nèi)實驗:通過建立Balb/c小鼠肝癌H22細(xì)胞皮下種植模型,觀察并評價溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4對腫瘤的抑制和延長生存情況。(3)小鼠治療后,眼球取血,收集血清,通過血凝抑制實驗(HI)檢測小鼠產(chǎn)生的保護(hù)性抗體情況。結(jié)果:MTS檢測結(jié)果顯示,1.0 MOI的重組病毒P=0.0307(P0.05)、2.0 MOI的重組病毒P=0.0017(P0.01),5.0 MOI的重組病毒P=0.0011(P0.01),2.0 MOI、5.0 MOI的病毒相比1.0 MOI組H22細(xì)胞活力顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性,表明r Flu-mu CTLA-4能特異性殺傷H22細(xì)胞(P0.05)。在小鼠模型中能顯著抑制腫瘤體積,并延長小鼠的生存期。在血凝抑制實驗檢測到了較高的血凝抑制抗體效價,實驗結(jié)果表明重組溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性的抗體。結(jié)論:重組溶瘤流感病毒r Flu-mu CTLA-4在體內(nèi)、外能靶向殺傷肝癌細(xì)胞,并能夠抑制小鼠腫瘤體積的增長,延長小鼠的生存期,并且給予病毒治療后小鼠的體內(nèi)可以產(chǎn)生較高的保護(hù)性抗體,此研究有望為溶瘤病毒靶向治療肝癌提供新的思路。
【圖文】：

學(xué)碩士研究生學(xué)位論文（2019） 釋放到細(xì)胞或血液循環(huán)中的一類物質(zhì)，病原體相關(guān)的分子模式是病原體上兩者均被模式識別受體識別引起免疫應(yīng)答。溶瘤病毒又可促進(jìn)樹突細(xì)胞浸瘤免疫應(yīng)答的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associatedantigen，TAA）的交叉呈遞統(tǒng)性的抗腫瘤免疫反應(yīng)[9]（Fig. 1）。大多數(shù)可用的溶瘤病毒均為經(jīng)過基靶向性較強(qiáng)，，并降低非腫瘤性宿主細(xì)胞的毒力[10]。因此，它們可以通過增別和隨后的免疫激活來刺激促炎環(huán)境，從而抵消惡性細(xì)胞的免疫逃避。還可利用腫瘤的致耐受性機(jī)制，促進(jìn)病毒感染和殺死不受免疫系統(tǒng)保護(hù)的

點抑制劑毒療法雖然在治療腫瘤中潛力巨大，但其作為單一療法實現(xiàn)腫瘤的治因此，現(xiàn)在正在努力尋找可以進(jìn)一步增強(qiáng)溶瘤病毒抗腫瘤功效的合理之一是通過免疫檢查點療法支持溶瘤病毒介導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡。查點是指在免疫系統(tǒng)中存在的一些抑制性信號通路，細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)otoxic T lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4）是 T淋巴細(xì)胞激活激因子。CTLA4 與抗原遞程細(xì)胞上的 B7結(jié)合，降低白介素-2及其受胞的細(xì)胞周期停滯于 Gl 期等，進(jìn)而抑制 T淋巴細(xì)胞的增殖[34,7]。程序programmed death protein-1, PD-1）為Ⅰ型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋中的一員，是另一重要的免疫抑制受體，但是 PD-1的功能與 CTL，PD-1 主要調(diào)節(jié)組織和腫瘤內(nèi)的效應(yīng) T 細(xì)胞活性，而不是在 T 細(xì)胞用[35]。免疫檢查點抑制劑 anti-CTLA-4 和 anti-PD-1 能夠釋放參與維細(xì)胞因子，而活化的 T 細(xì)胞可以破壞腫瘤細(xì)胞（Fig. 2）。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;Q78

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