【摘要】：七鰓鰻是迄今為止在海洋生物中發(fā)現(xiàn)的最原始的無頜類脊椎動物之一。其化石距今約3.6億年,因此七鰓鰻被稱為“活化石”。由于其在進化地位上的特殊性,長久以來,七鰓鰻都具有很大的研究價值。Nucleolin是真核細胞核仁中一種重要的蛋白質,具有多種重要的細胞功能,在細胞增殖、死亡、免疫,尤其在rRNA合成和免疫中扮演重要的角色。本論文首次在日本七鰓鰻(Lampetra japonica)中發(fā)現(xiàn)了nucleolin(核仁素,C23)的同源物(nucleolin-like),對其進行了研究,初步取得了如下研究成果。首先,本論文成功從日本七鰓鰻的白細胞cDNA文庫中克隆出長度為1941bp,編碼為646個氨基酸的nucleolin-like全長基因。經(jīng)過同源序列比對發(fā)現(xiàn),該基因和其他脊椎動物nucleolin具有約50%的同源性。同時,構建了不同物種nucleolin的進化樹,發(fā)現(xiàn)nucleolin-like的進化位置介于無脊椎動物和魚類之間,與七鰓鰻在物種進化中的位置一致。其次,將nucleolin-like C端片段進行克隆并構建到pET-28a載體中,獲得原核表達重組質粒。在E.coli BL21中表達原核蛋白,并純化。用純化蛋白免疫新西蘭大白兔,制備得到anti-nucleolin-like多克隆抗體,并驗證了抗體的效價和特異性。通過real-time PCR、western blot和流式細胞術分析手段對nucleolin-like在日本七鰓鰻體內(nèi)組織分布以及表達情況進行檢測。結果表明,nucleolin-like在日本七鰓鰻白細胞和所有組織的mRNA水平均有表達,而在白細胞、鰓、腎和髓組織中的表達量更為明顯。最后,以Poly(I:C)刺激日本七鰓鰻白細胞,白細胞中nucleolin-like的mRNA水平和蛋白表達水平在Poly(I:C)的刺激下均有提高。同時發(fā)現(xiàn),Poly(I:C)的刺激能夠使nucleolin-like由細胞核轉移到細胞質中。以上結果表明,nucleolin-like在七鰓鰻的先天性免疫應答中可能扮演著與人源nucleolin相似的重要角色。綜上所述,本論文首次在日本七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)并克隆得到了nucleolin-like的全長基因;成功制備了anti-nucleolin-like的多克隆抗體;探明了其在日本七鰓鰻各組織中的分布;對Poly(I:C)刺激后nucleolin-like在細胞中的表達與轉位情況進行了初探。為進一步研究nucleolin-like在七鰓鰻先天性免疫中的作用奠定了基礎。
【圖文】：

日本七鰓鰻 Nucleolin-like基因的克隆及其在先天性免疫中的功能初探本七鰓鰻的白細胞總 RNA七鰓鰻的白細胞中提取總 RNA，用分光光度計檢測其0 為 1.92，處于 1.8-2.0 范圍內(nèi)，說明 RNA 純度較好。根據(jù)計算μg/mL，取 2 μL RNA 溶液進行電泳檢測。結果顯示，白細胞 R帶較為清楚（圖 2.1），證明 RNA 的提取效果較好。

圖 2.2 日本七鰓鰻 nucleolin-like EST 序列 PCR 電泳圖M: DL 5000 Marker; 1: Nucleolin-like EST 序列Fig. 2.2 PCR electropherogram of nucleolin-like EST sequence of L. japonicM: DL 5000 Marker; 1: The nucleolin-like EST sequenceucleolin-like EST 序列與 T 載體連接，，并轉化到 DH5α中，之后進粒（圖 2.3），提質粒（圖 2.4）后送往生物公司進行測序。
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q95

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