【摘要】：任何生物都是在一定的溫度范圍內(nèi)活動,溫度是對生物影響最為明顯的環(huán)境因素之一。溫度能影響生物的生活狀態(tài)、棲息分布、性別決定、生長發(fā)育以及存活。極端溫度會造成生物體的損傷,如高溫會使生物機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài),發(fā)生代謝功能紊亂,活性氧異常且迅速增多,損傷細(xì)胞中核酸、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì),導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化還原失衡,發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),破壞正常的生理功能。因此高溫是引發(fā)生物體氧化應(yīng)激的最常見的原因。生物體內(nèi)的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)等,維持著體內(nèi)氧化平衡,而這些酶會受到相應(yīng)基因的調(diào)控。FoxO是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員,廣泛存在于各種真核生物中,參與多種生物學(xué)功能包括抗氧化應(yīng)激、凋亡和自噬、DNA損傷與修復(fù)、細(xì)胞周期以及能量代謝。已有研究報道哺乳動物FoxO家族中FoxO3a通過調(diào)控錳超氧化物歧化酶(MnSOD)來清除細(xì)胞內(nèi)ROS從而降低細(xì)胞氧化損傷,表明FoxO參與了哺乳動物中的氧化應(yīng)激調(diào)控。家蠶是歷史悠久的經(jīng)濟(jì)動物,為中華民族經(jīng)濟(jì)發(fā)展和絲綢文化傳播做出了卓越貢獻(xiàn)。以“框架圖、精細(xì)圖和遺傳變異圖”為標(biāo)志的家蠶基因組計劃“三部曲”的完成,推動了家蠶轉(zhuǎn)基因等功能基因研究與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)平臺的建立。家蠶屬于鱗翅目模式昆蟲且是變溫動物,外界的溫度變化對家蠶生長發(fā)育起著關(guān)鍵性作用。高溫處理導(dǎo)致家蠶存活率降低,這與體內(nèi)的ROS增多有關(guān)。我國養(yǎng)蠶主要在南方高溫地區(qū)較多,研究家蠶的抗高溫機(jī)制以及培育抗高溫品種對于養(yǎng)蠶業(yè)的發(fā)展具有較重要的意義。然而在家蠶中BmFoxO是否參與調(diào)控高溫脅迫產(chǎn)生的氧化應(yīng)激以及如何調(diào)控尚未見報道,因此本研究首先明確家蠶受到高溫或者H_2O_2氧化脅迫后的分子變化以及造成的損傷情況,通過在BmE細(xì)胞過量表達(dá)BmFoxO來探究其對高溫及氧化應(yīng)激的影響,最后以BmE細(xì)胞作為對象,闡述BmFoxO調(diào)控家蠶氧化應(yīng)激的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.家蠶響應(yīng)高溫以及H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激用37℃高溫處理家蠶,與對照25℃相比,脂肪體中ROS含量逐漸升高,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測家蠶脂肪體氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平,結(jié)果顯示在高溫脅迫處理一定時間內(nèi)BmFoxO以及抗氧化酶相關(guān)基因BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAT以及BmGADD45基因均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),而抗氧化酶BmGpx下調(diào)表達(dá)。利用生理生化試劑盒檢測結(jié)果顯示SOD和CAT酶活呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在H_2O_2脅迫處理一定時間內(nèi)BmFoxO及抗氧化酶相關(guān)基因出現(xiàn)與高溫處理一致的變化趨勢。利用生理生化試劑盒檢測結(jié)果顯示ROS含量逐漸升高,而SOD和CAT酶活也出現(xiàn)與高溫處理一致的變化趨勢。以上結(jié)果表明高溫或者H_2O_2會誘導(dǎo)家蠶氧化應(yīng)激反應(yīng),且會使BmFoxO發(fā)生上調(diào)表達(dá)。2.在BmE細(xì)胞胞中中BmFoxO抵抗抗氧氧化化應(yīng)應(yīng)激激損損傷傷為了探索其高溫或者H_2O_2誘導(dǎo)氧化損傷的機(jī)制,我們首先在BmE細(xì)胞中驗證高溫或者H_2O_2造成氧化損傷并在細(xì)胞上探索其機(jī)制。首先使用CCK-8試劑盒檢測BmE細(xì)胞在37℃處理0、12、24和48 h后的活力變化,結(jié)果顯示細(xì)胞活力隨處理時間延長逐漸降低,并且用DCFH-DA探針檢測顯示細(xì)胞在37℃處理12 h后ROS含量明顯增多。熒光定量PCR結(jié)果顯示細(xì)胞受到高溫誘導(dǎo)后氧化應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和抗氧化酶基因(除BmGpx外)表達(dá)量均上調(diào)。生理生化試劑盒檢測結(jié)果表明高溫處理后,細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT酶活上升,MDA和H_2O_2含量顯著增加。結(jié)果表明高溫脅迫會誘導(dǎo)BmE細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。高溫和H_2O_2在家蠶中造成的氧化損傷趨勢一致,為了更好地闡釋氧化損傷的分子機(jī)制,我們選擇H_2O_2處理進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗。分別使用終濃度為0、250、500、1000、2000μM的H_2O_2處理細(xì)胞后檢測其活力變化,發(fā)現(xiàn)在濃度為1000μM以上的H_2O_2處理細(xì)胞后細(xì)胞活力出現(xiàn)不可逆下降,同時ROS含量明顯增多。隨H_2O_2濃度增加,BmFoxO、BmSOD1、BmSOD2、BmSOD3、BmCAT和BmGADD45基因表達(dá)量逐漸升高,與家蠶中的表達(dá)變化趨勢一致。SOD和CAT酶活和MDA含量持續(xù)升高。為了探究BmFoxO在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮何種功能,構(gòu)建了BmFoxO過表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BmFoxO的細(xì)胞在高溫或H_2O_2處理后ROS含量相較于對照組明顯降低,細(xì)胞DNA損傷和死亡率顯著降低。以上結(jié)果說明高溫或者H_2O_2處理BmE細(xì)胞造成的氧化損傷與家蠶中一致,并且過表達(dá)BmFoxO能夠減少BmE細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷。3.BmFoxO參與家蠶氧化應(yīng)激的機(jī)制探究FoxO是蛋白激酶B(PKB或者Akt)的主要底物,其活性取決于磷酸化水平。胰島素和生長因子會使FoxO定位到細(xì)胞質(zhì)最終被降解,而磷酸化的FoxO會定位于細(xì)胞核從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。為了明確BmFoxO受高溫、H_2O_2處理后的活性影響,我們檢測了BmFoxO的亞細(xì)胞定位情況,構(gòu)建了帶有EGFP的BmFoxO過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)37℃或H_2O_2處理都會使BmFoxO的定位從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞受到H_2O_2脅迫后,BmFoxO大量在細(xì)胞核蛋白中被檢測到,表明BmFoxO轉(zhuǎn)錄活性在高溫和氧化應(yīng)激損傷中增加。在H_2O_2處理后檢測到細(xì)胞中Akt的磷酸化水平降低,說明H2O2抑制了Akt蛋白的磷酸化水平。為了探索BmFoxO的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,我們對抗氧化酶基因啟動子序列進(jìn)行分析,預(yù)測到了Forkhead轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序。為了明確BmFoxO是否直接調(diào)控這些基因,設(shè)計引物并構(gòu)建了雙熒光素報告載體,雙熒光素酶活實(shí)驗顯示BmFoxO能上調(diào)SOD1,SOD2,CAT,GADD45這些抗氧化酶基因的啟動子活性,而且組成型形式的BmFoxO~(CA)對這些啟動子活性的上調(diào)效果更為明顯。為了進(jìn)一步確定BmFoxO對抗氧化基因的調(diào)控作用,設(shè)計了帶有生物素標(biāo)記的探針,EMSA實(shí)驗表明BmFoxO可以與CRE3探針發(fā)生特異性的結(jié)合。綜上結(jié)果表明H_2O_2通過抑制Akt磷酸化使BmFoxO定位于細(xì)胞核,從而增強(qiáng)抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄活性,來清除細(xì)胞內(nèi)ROS,降低細(xì)胞受到的氧化損傷。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q965

【參考文獻(xiàn)】

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1 馮雪鳳;王迎偉;;DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因Gadd45的研究進(jìn)展[J];癌變.畸變.突變;2009年05期

2 馬森;;谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2008年10期

3 叢海峰;徐世清;司馬楊虎;張升祥;王更先;董航;劉瑩;柳學(xué)廣;;野桑蠶銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆分析與原核表達(dá)[J];蠶業(yè)科學(xué);2007年02期

4 楊唐斌，，梅尚筠;熱休克對家蠶幼蟲抗氧化酶活性的影響[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1996年02期

本文編號：2685951