【摘要】：木麻黃(Casuarina equisetifolia L.)是海南省重要的海防林樹種,但隨著林齡的增長,木麻黃林出現(xiàn)自我更新困難的問題,其主要原因是化感物質(zhì)的積累。我們前期的研究表明,引起木麻黃化感作用的物質(zhì)除自身次生代謝合成和土壤微生物合成外,木麻黃植株內(nèi)生真菌也是化感物質(zhì)的來源。因此,本文運用高通量測序平臺,分析不同林齡木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性;利用傳統(tǒng)的分離方法分離純化不同林齡根內(nèi)生細(xì)菌并用16s DNA進(jìn)行菌種鑒定;用分離鑒定出的不同內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對木麻黃種子進(jìn)行處理,以探究不同內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對木麻黃種子萌發(fā)的化感潛力;此外,挑選3種對木麻黃種子萌發(fā)化感潛力最強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌,利用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對其發(fā)酵液的甲醇和正己烷萃取液進(jìn)行鑒定,并與前期相應(yīng)林齡的木麻黃根、土壤水浸提液的甲醇和正己烷萃取液鑒定出的物質(zhì)成分進(jìn)行比較。其研究結(jié)果不僅可以闡明木麻黃植株內(nèi)生細(xì)菌參與化感作用的理論基礎(chǔ),也可為后續(xù)采用工程菌株或微生物制劑進(jìn)行木麻黃林的更新和改造提供實踐指導(dǎo)。本文研究結(jié)果如下:1.通過高通量測序?qū)τ�、中、成齡林木麻黃根基因組DNA進(jìn)行16S rDNA定向測序,共得到330447條平均長度約為430-448bp的序列。不同林齡木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌物種組成豐富,中齡林根內(nèi)生細(xì)菌的多樣性最高,成熟林次之,幼齡林最低。此外,3個林齡內(nèi)生細(xì)菌在群落結(jié)構(gòu)上有一定的差異,其中幼齡林和成熟林根內(nèi)生細(xì)菌的群落組成較相似,與中齡林存在差異。幼齡林和成熟林均主要以變形菌門假單胞菌科的假單胞菌屬、厚壁菌門芽孢桿菌科的芽孢桿菌屬和厚壁菌門腸球菌科的腸球菌屬為主;而中齡林中占主導(dǎo)地位的為變形菌門黃單胞菌科的黃單胞菌屬以及放線菌門嗜酸棲熱菌科的嗜酸棲熱菌屬。土壤的理化性質(zhì)如有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮對不同林齡木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌的組成有顯著影響。說明木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性受林齡、環(huán)境因子等因素的影響。2.采用傳統(tǒng)的分離方法從3個林齡木麻黃根中分離內(nèi)生細(xì)菌,對分離得到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察并結(jié)合16S rDNA序列測定及同源性分析。結(jié)果表明,分離得到的36株內(nèi)生細(xì)菌屬于9屬21種,其中芽孢桿菌屬(Bacillus)6種,占總菌種數(shù)的28.57%,為優(yōu)勢種;不動桿菌屬(Acinetobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)各3種,各占總菌種數(shù)的14.29%,為次優(yōu)勢種。此外,幼齡林5屬8種,占總菌種數(shù)的38.10%;中齡林6屬10種,占總菌種數(shù)的47.62%;成熟林6屬11種,占總菌種數(shù)的52.38%。3.不同木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對木麻黃種子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用,并降低了種子的發(fā)芽率。其中,解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)發(fā)酵液對種子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng),化感效應(yīng)指數(shù)為-1;其次是阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai),化感效應(yīng)指數(shù)為-0.99;而蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)發(fā)酵液的抑制作用最弱,化感效應(yīng)指數(shù)為-0.008。4.通過GC-MS技術(shù)在不同木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物中檢測出酚、酮、酯、有機(jī)酸、醇類等有機(jī)化合物,其中2,2’-亞甲基雙-[4-甲基-6-叔丁基]苯酚和1,2,3,4-丁四醇2種化合物為內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物與根、土壤浸提液所共有;而4-甲氧基-3,5-二羥基苯甲酸、3,4,5-三羥基苯甲酸、對苯二胺、3-氨基苯酚和3,5-二甲氧基苯酚5種化合物為內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物所特有。以上結(jié)果表明,木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌的多樣性是隨著林齡發(fā)生變化的,且與有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮等環(huán)境因子密切相關(guān)。此外,可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物可對木麻黃種子產(chǎn)生化感作用,表明木麻黃內(nèi)生細(xì)菌可通過直接產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物參與木麻黃化感物質(zhì)的合成,也有可能是內(nèi)生細(xì)菌通過與木麻黃植株進(jìn)行遺傳信息的傳遞或基因交換等互作調(diào)控參與化感物質(zhì)的合成。
【圖文】：

3_3 32625 14610106 448總計 330447 146279681 39812.4.1 物種注釋與評估不同林齡木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌的樣本測序量評估曲線如圖 2-1 所示。由 Sobs 曲線（圖2-1a）可知，測序數(shù)據(jù)量在 0-10000 范圍內(nèi)所觀測到的物種數(shù)量呈逐漸上升的趨勢；測序數(shù)量超過 10000 之后各樣本曲線趨于平緩，說明測序數(shù)量充分。由香農(nóng)曲線（圖 2-1b）可知，起初各樣本 Shannon 指數(shù)隨測序量的增加而直線上升，隨后曲線趨于平坦，說明測序條數(shù)足以覆蓋樣品中的絕大部分微生物。由相對豐度曲線（圖 2-1c）可知，各樣本隨 OTU 等級增加，曲線逐漸趨于平緩，說明各樣本的物種分布較均勻。以上結(jié)果說明本次測序序列數(shù)基本合理，實驗數(shù)據(jù)有參考價值。

圖 2-3 屬水平上不同樣本間共有及特有 OTUFig. 2-3 OTU that Shared or unique between different samples at the genus level2.4.2.2 群落組成分析3 個林齡木麻黃根內(nèi)生細(xì)菌群落在門分類水平上的分布比例見圖 2-4a。由圖可知個林齡樣品中內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相近，但各細(xì)菌類群所占比例存在差異，優(yōu)勢群主要隸屬于 6 門(所占比例大于 1%)。其中幼齡林和成熟林的優(yōu)勢菌門為變形菌（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），變形菌門在幼齡林和成熟林中所占比例別為 48.72%和 46.98%，厚壁菌門在幼齡林和成熟林中所占比例分別為 42.97%和 39.而中齡林中占主導(dǎo)地位的菌門為變形菌門和放線菌門（Actinobacteria），它們所占的例分別為 36.71%和 33.77%。雖然厚壁菌門在幼齡林和成熟林中所占的比例相差不大約為中齡林中的 6 倍，但是放線菌門在中齡林中所占比例為 33.77%，而該菌門在幼林和成熟林所占比例僅為 1.95%和 5.34%。此外，酸桿菌門（Acidobacteria）和藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）在中齡林中所占比例分別為 9.69%和 7.56%，而這 2 個菌門在
【學(xué)位授予單位】：海南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q93;S792.93

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳澤斌;李冰;王定康;余磊;徐勝光;任y，

本文編號：2684030