【摘要】：漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,其作用底物廣泛且對環(huán)境無害,有著巨大應(yīng)用潛力,但其大規(guī)模應(yīng)用收到酶的經(jīng)濟(jì)性和效率的制約,性質(zhì)優(yōu)良的漆酶菌株的篩選和構(gòu)建具有重要的價(jià)值和意義。論文以產(chǎn)漆酶菌株SYBC L48為研究對象,對其進(jìn)行了分子鑒定,研究了其發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基組成、漆酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)、漆酶在合成染料脫色中的應(yīng)用,并對其漆酶基因進(jìn)行了克隆和外源表達(dá),主要結(jié)果如下:(1)對實(shí)驗(yàn)室保藏的一株產(chǎn)漆酶真菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定,確定菌株SYBC L48屬于靈芝屬(Ganoderma)真菌,命名為Ganoderma sp.SYBC L48。優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:蔗糖12 g·L~(-1)、豆粕6 g·L~(-1)、CuSO_4·5H_2O 0.5 mmol·L~(-1)、KCl 0.5 g·L~(-1)、KH_2PO_4 1g·L~(-1)、MgSO_4·7H_2O 0.5 g·L~(-1),MnSO_4·H_2O 0.01 g·L~(-1)。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基下,Ganoderma sp.SYBC L48漆酶酶活最高達(dá)2598 U·L~(-1),比優(yōu)化前提高了35.1%。(2)經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、DEAE-FF離子交換層析兩步純化后得到了電泳純的Ganoderma sp.SYBC L48漆酶蛋白,純化倍數(shù)為13.2倍,回收率21.5%,分子量約為60kDa。純化后漆酶的最適反應(yīng)溫度為60℃,溫度穩(wěn)定性較好,20~60℃保溫1 h能保持80%以上的酶活力;最適pH為2.5,在pH 5.0~9.0范圍內(nèi),25℃保溫24 h仍能保持80%以上的酶活力;Co~(2+)、Cr~(3+)、Fe~(3+)對酶活力有抑制作用。以ABTS(2,2'-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))為底物時(shí),K_m值為0.044 mmol·L~(-1)。(3)純化后的漆酶酶液對活性亮藍(lán)、酸性紅1和孔雀石綠這3種染料的脫色效果明顯,反應(yīng)120 min后脫色率可分別達(dá)到76.6%、90.3%和58.1%。使用小麥種子和小球藻對染料及其漆酶降解產(chǎn)物的毒性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明酶處理后染料的毒性減弱。(4)擴(kuò)增得到了Ganoderma sp.SYBC L48漆酶全長結(jié)構(gòu)基因lac1和相應(yīng)的全長cDNA序列。生物信息學(xué)分析表明lac1漆酶基因共編碼525個(gè)氨基酸,其中前22個(gè)氨基酸被預(yù)測為信號肽序列,其編碼的蛋白預(yù)測分子量為57.2 kDa(不包括糖基化),等電點(diǎn)為5.23。隨后成功實(shí)現(xiàn)了lac1基因在畢赤酵母中的異源表達(dá)。
【圖文】：

Trametes trogii 漆酶的晶體結(jié)構(gòu)立體 Stereo view of Trametes trogii laccas漆酶-介體系統(tǒng)步驟：與漆酶結(jié)合，Ⅰ型銅離子從底物核銅離子中心(TNC)。從 T1Cu 傳遞的電子后，依次，Solomon 等提出了一個(gè)較為的殘基，，顯著降低了 T2Cu 和2Cu 被還原，T3Cub最后被還原還原為水。氧分子通過蛋白表水分子再由另一條水通道被釋研究者們普遍同意在反應(yīng)過程中

圖 1-2 介體存在下漆酶催化底物氧化反應(yīng)機(jī)理Fig. 1-2 Reaction mechanism of laccase catalytic oxidation with mediators用
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;Q814

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本文編號：2678154