【摘要】：microRNA-7是一種在各物種間序列高度保守的microRNA。已有研究表明,microRNA-7在疾病的發(fā)生、器官的發(fā)育、癌癥的產(chǎn)生等生物活動中發(fā)揮著重要的作用,并且在內(nèi)分泌器官中有較高水平的表達(dá)。然而,其在動物生殖發(fā)育過程中的作用及機(jī)理尚不明確。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了 microRNA-7三種亞型的基因敲除小鼠模型,并對其雄性生殖力進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步研究microRNA-7在動物生殖發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。首先,利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測了成年小鼠各組織器官中microRNA-7的表達(dá)水平。結(jié)果表明microRNA-7在垂體、下丘腦、腎上腺等內(nèi)分泌組織中具有高水平的表達(dá),并在睪丸、子宮、附睪等生殖器官中具有較高水平的表達(dá)。此外,原位雜交檢測結(jié)果表明,microRNA-7在小鼠睪丸中的支持細(xì)胞及各階段生殖細(xì)胞中均有表達(dá)。其次,利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù),構(gòu)建了 microRNA-7a1、microRNA-7a2以及microRNA-7b基因敲除小鼠模型。通過采用目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增、測序、Real-time PCR的檢測方法,對小鼠模型進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明microRNA-7三種亞型基因敲除小鼠均為基因序列大片段缺失個體,且缺失位于microRNA-7成熟序列區(qū)域。microRNA-7三種亞型基因敲除小鼠的microRNA-7基因表達(dá)水平都有極顯著的降低。利用T7EI法對基因敲除小鼠潛在脫靶基因進(jìn)行檢測,結(jié)果表明三種microRNA-7基因敲除小鼠模型中均不存在脫靶效應(yīng)。對microRNA-7三種亞型基因敲除小鼠模型的表型分析,發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠的出生率和成活率較野生型小鼠相比無明顯差異。microRNA-7a2基因敲除成年小鼠的睪丸、附睪、子宮組織的體積與重量較野生型相比有顯著性的減小和降低。但microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除成年小鼠各組織器官重量和形態(tài)與野生型小鼠相比無明顯差異。配種實驗結(jié)果表明,microRNA-7a2基因的缺失會導(dǎo)致雄性和雌性小鼠的不育,然而microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除小鼠與野生型小鼠相比繁殖力無顯著性差異。對microRNA-7a2基因敲除成年小鼠睪丸和附睪組織進(jìn)行切片染色觀察,結(jié)果顯示,睪丸中部分曲細(xì)精管的生精上皮中有空洞產(chǎn)生,附睪組織結(jié)構(gòu)無明顯變化,但附睪尾管腔中精子的數(shù)量明顯減少。對microRNA-7a2基因敲除雄性小鼠精子活力檢測發(fā)現(xiàn),其精子數(shù)目、精子運(yùn)動能力都較野生型小鼠相比有顯著性的降低。血清中促性腺激素檢測表明,雄性microRNA-7a2基因敲除小鼠血清中促卵泡激素(FSH)與黃體生成素(LH)的激素水平均有顯著性的下降。最后,為進(jìn)一步研究microRNA-7a2在雄性小鼠生殖系統(tǒng)中的作用和功能,我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功的構(gòu)建了 Loxp序列標(biāo)記的microRNA-7a2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(microRNA-7a2flox/flox),為microRNA-7a2條件性基因敲除小鼠模型的建立奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的microRNA-7三種亞型基因敲除小鼠模型具有高可靠性,可以用于microRNA-7功能及其作用機(jī)理的研究。另外,本研究結(jié)果表明microRNA-7a2的缺失會造成雄性小鼠不育,生殖系統(tǒng)功能的改變,說明microRNA-7a2在小鼠的生殖發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。
【圖文】：

（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ），通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別基因，并逡逑根據(jù)互補(bǔ)程度的不同進(jìn)而指導(dǎo)ＲＩＳＣ降解靶ｍＲＮＡ或者阻礙靶基因ｍＲＮＡ的翻譯。逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ的生物成及加工具體過程如下（圖１－１）：逡逑首先，ｍｉｃｒｏＲＮＡ基因在ＲＮＡ聚合酶ＩＩ邋（ｐｏｌ邋ＩＩ）的作用下，在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄，逡逑產(chǎn)生一個長鏈的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其稱為ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ。其在結(jié)構(gòu)上與ｍＲＮＡ類似，具逡逑有５’帽子（７ｍＧｐｐｐＧ）和３’多聚腺苷酸尾巴（５’－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’）結(jié)構(gòu)，長度逡逑一般大于ｌｋｂ。逡逑其次，在細(xì)胞核中，ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ在三型核酸內(nèi)切酶Ｄｒｏｓｈａ與雙鏈ＲＮＡ結(jié)合蛋白逡逑ＤＧＣＲ８形成的微型處理復(fù)合體中進(jìn)行切割，產(chǎn)生大小為７０？８０個核苷酸左右的前體逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ，稱為ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ。產(chǎn)生的ｐｒｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ序列中有部分堿基反向互補(bǔ)，逡逑進(jìn)而形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)（Ｄｅｎｌｉｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑然后

１．２邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７邋研究概述逡逑１．２．邋１邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７邋的表達(dá)逡逑在兩側(cè)對稱的物種中，ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７序列在進(jìn)化上具有高度保守性（圖１－２）和逡逑組織特異性，這表明ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７在生物的生命活動中發(fā)揮著重要的作用逡逑（Ｈｏｒｓｈａｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１５）。逡逑在人體中，ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７有三個來自不同基因成員的亞型，，分別為ｍｉｃｒｏＲＮＡ＿７－ｌ，逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－２邋和邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－３。ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７＿ｌ邋存在于邋９邋號染色體邐基因的逡逑內(nèi)含子中；ｍｉｃｒｏＲＮＡ＿７－２存在于５號染色體的基因間；ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－３存在于１９號逡逑染色體ＰＧＳＦｌａ的內(nèi)含子中。每一種ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７基因獨立轉(zhuǎn)錄形成獨有的ｍｉｃｒｏＲＮＡ逡逑初級轉(zhuǎn)錄物邋ｐｒｉ－ｍｉＲ－７－１，ｐｒｉ－ｍｉＲ－７－２邋和邋ｐｒｉ－ｍｉＲ－７－３，隨后形成獨立的邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ逡逑前體邋ｐｒｅ－ｍｉＲ－７－１，ｐｒｅ－ｍｉＲ－７－２邋和邋ｐｒｅ－ｍｉＲ－７－３邋（Ｈａ邋ａｎｄ邋Ｋｉｍ，邋２０１４ｂ），最后所有的逡逑前體形成相同的成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７序列。有研宄表明，ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－１和逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７－２會受到自己宿主基因的轉(zhuǎn)錄因子ＨＯＸＤ１０和ｃ－Ｍｙｃ的直接調(diào)控逡逑（Ｃｈｏｕ邋ｅｔ邋ａｌ．？邋２０１０；邋Ｒｅｄｄｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８）0逡逑與人基因組中ｍｉｃｒｏＲＮＡ－７分布情況類型
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q492;Q78

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