【摘要】：抗生素作為一大類高毒性、高殘留的有機(jī)污染物已引起環(huán)境學(xué)者的廣泛關(guān)注�？股剡M(jìn)入土壤后會(huì)破壞原有土壤環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài),并影響土壤功能酶的生物活性,打破土壤功能酶參與碳、氮、磷循環(huán)的平衡,進(jìn)而對(duì)土壤功能造成嚴(yán)重的破壞。鑒于此,探究各類抗生素的毒性差異、闡明其毒性作用機(jī)制已成為環(huán)境研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前關(guān)于抗生素對(duì)土壤的污染現(xiàn)狀已被廣泛探討,但有關(guān)抗生素對(duì)土壤功能酶活性的致毒作用仍缺乏系統(tǒng)的研究。同時(shí),抗生素對(duì)土壤功能酶的分子致毒機(jī)制尚未闡明,制約了從本質(zhì)上評(píng)價(jià)抗生素對(duì)土壤功能酶的污染機(jī)理。本研究選取土壤脲酶作為抗生素靶向目標(biāo),主要考察六類典型抗生素對(duì)土壤脲酶的毒性抑制和作用機(jī)制。通過(guò)分子毒性實(shí)驗(yàn)分別得到不同抗生素對(duì)土壤脲酶活性的致毒作用;借助傳統(tǒng)熒光光譜和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)抗生素與土壤脲酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析;將理論模擬數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)照,闡明六類典型抗生素對(duì)土壤脲酶活性的毒性作用差異機(jī)制,建立評(píng)價(jià)抗生素生物毒性效應(yīng)的新方法。主要研究工作如下:(1)首先,通過(guò)分子毒性實(shí)驗(yàn)考察六類典型抗生素對(duì)土壤脲酶活性的影響效果。喹諾酮類抗生素諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和β-內(nèi)酰胺類抗生素青霉素、頭孢氨芐、阿莫西林對(duì)土壤脲酶活性的作用效果均整體表現(xiàn)為抑制作用(除環(huán)丙沙星對(duì)土壤脲酶活性無(wú)明顯作用);四環(huán)素類抗生素四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素對(duì)土壤脲酶活性的作用效果整體均表現(xiàn)為促進(jìn)作用;除阿奇霉素對(duì)土壤脲酶活性表現(xiàn)出促進(jìn)作用外,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素、克拉霉素、羅紅霉,氨基糖苷類抗生素卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素和磺胺類抗生素磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑?qū)ν寥离迕富钚跃鶡o(wú)明顯的作用效果。(2)接下來(lái),通過(guò)熒光光譜技術(shù)考察六類典型抗生素與土壤脲酶的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明六類典型抗生素與土壤脲酶的相互作用過(guò)程中,土壤脲酶的熒光強(qiáng)度具有明顯的下降趨勢(shì),即抗生素與土壤脲酶發(fā)生了猝滅作用。結(jié)合分子毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可推斷六類典型抗生素與土壤脲酶相互作用的差異類型:喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和β-內(nèi)酰胺類抗生素青霉素、頭孢氨芐、阿莫西林于土壤脲酶的催化活性中心發(fā)生靜態(tài)猝滅;四環(huán)素類抗生素四環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素于土壤脲酶的非催化活性中心發(fā)生靜態(tài)猝滅;大環(huán)內(nèi)脂類抗生素紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、環(huán)丙沙星,氨基糖苷類抗生素卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素和磺胺類抗生素磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶于土壤脲酶的非催化活性中心發(fā)生靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)猝滅。(3)最后,通過(guò)MOE分子模擬軟件對(duì)六類典型抗生素與土壤脲酶進(jìn)行分子對(duì)接,可以從毒物與土壤脲酶結(jié)合前后整體能量變化、結(jié)合面積、氫鍵、離子鍵作用層次對(duì)抗生素抑制土壤脲酶生物活性的差異機(jī)制進(jìn)行闡釋。結(jié)果表明:(1)喹諾酮類抗生素在土壤脲酶的催化活性中心與其結(jié)合形成復(fù)合物,對(duì)土壤脲酶活性產(chǎn)生明顯的抑制作用。復(fù)合物整體結(jié)合面積和毒物毒性變化存在正相關(guān)性,可作為評(píng)價(jià)該類抗生素對(duì)土壤脲酶致毒機(jī)制的重要指標(biāo);喹諾酮類抗生素-土壤脲酶結(jié)合能量的變化應(yīng)歸結(jié)于氫鍵、離子鍵等相互作用,兩者對(duì)接后整體能量下降程度與毒物毒性變化正相關(guān),表明該能量變化值可作為評(píng)價(jià)該類抗生素毒性的重要指標(biāo);在喹諾酮類抗生素和土壤脲酶的相互作用中,O~(25)←Lys_(443)、C~6→Glu_(369)等氫鍵作用和N~4-Asp_(79)、O~(25)-Lys_(443)等離子鍵作用與毒物毒性變化正相關(guān);O~(23)←Lys_(443)、N~4→Asp_(103)等氫鍵作用和N~4-Glu_(503)等離子鍵作用和毒物毒性變化負(fù)相關(guān),即以上作用越強(qiáng)毒物對(duì)土壤脲酶抑制作用越小;環(huán)丙沙星與土壤脲酶形成的氫鍵、離子鍵作用對(duì)毒物毒性變化相關(guān)性較小;催化活性中心的兩個(gè)Ni~(2+)對(duì)結(jié)合過(guò)程未發(fā)現(xiàn)明顯的影響作用。(2)β-內(nèi)酰胺類抗生素在土壤脲酶的催化活性中心與其結(jié)合形成復(fù)合物,對(duì)土壤脲酶活性產(chǎn)生明顯的抑制作用。復(fù)合物的整體結(jié)合面積和毒物毒性變化存在正相關(guān)性,可作為評(píng)價(jià)該類抗生素對(duì)土壤脲酶致毒機(jī)制的重要指標(biāo);β-內(nèi)酰胺類-土壤脲酶結(jié)合能量的變化應(yīng)歸結(jié)于氫鍵、離子鍵等相互作用,兩者對(duì)接后整體能量下降程度與毒物毒性變化正相關(guān),表明該能量變化值可作為評(píng)價(jià)抗生素毒性的重要指標(biāo);在β-內(nèi)酰胺類抗生素和土壤脲酶的相互作用中,O~(63)←Lys_(443)、O~8←Asn_(46)等氫鍵作用和O~(13)-Arg_(94)、O~(13)-Arg_(52)等離子鍵作用等離子鍵作用與毒物毒性變化正相關(guān);S~4←Gly_(368)、O~(18)→Asp_(79)等氫鍵作用和O~(62)-Lys_(124)、O~(63)-Arg_(518)離子鍵作用與毒物毒性變化負(fù)相關(guān),即以上作用越強(qiáng)毒物對(duì)土壤脲酶抑制作用越小;催化活性中心的兩個(gè)Ni~(2+)對(duì)結(jié)合過(guò)程未發(fā)現(xiàn)明顯的影響作用。(3)四環(huán)素類抗生素在土壤脲酶的非催化活性中心與其結(jié)合形成復(fù)合物,由于四環(huán)素類抗生素與土壤脲酶非催化活性中心的相互作用導(dǎo)致其催化活性中心活性的改變,間接導(dǎo)致抗生素在土壤脲酶非催化活性中心對(duì)其產(chǎn)生促進(jìn)作用。四環(huán)素類抗生素與土壤脲酶的整體結(jié)合面積和毒物毒性變化存在正相關(guān)性,可作為評(píng)價(jià)抗生素對(duì)土壤脲酶致毒機(jī)制的重要指標(biāo);四環(huán)素類-土壤脲酶結(jié)合能量的變化應(yīng)歸結(jié)于氫鍵、離子鍵等相互作用,兩者對(duì)接后整體能量下降程度與毒物毒性變化正相關(guān),表明該能量變化值可作為評(píng)價(jià)抗生素毒性的重要指標(biāo);在四環(huán)素類抗生素和土壤脲酶的相互作用中,O~3→Phe_(567)、N~(21)→Phe_(567)等氫鍵作用和N~4-Glu_(311)、N~4-Phe_(567)等離子鍵作用與毒物毒性變化正相關(guān);C~4→Glu_(311)、O~1←Arg_(373)等氫鍵作用和N~4-Asp_(79)離子鍵作用與毒物毒性變化負(fù)相關(guān),即以上作用越強(qiáng)毒物對(duì)土壤脲酶抑制作用越小。(4)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類、磺胺類抗生素在土壤脲酶的非催化活性中心與其結(jié)合生成復(fù)合物,對(duì)土壤脲酶活性無(wú)明顯作用效果。氨基糖苷類、磺胺類抗生素、大環(huán)內(nèi)脂類(除阿奇霉素與土壤脲酶的整體結(jié)合面積、整體能量變化和毒物毒性有一定的相關(guān)性)與土壤脲酶的整體結(jié)合面積、整體能量變化和毒物毒性變化無(wú)相互作用效果;氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類、磺胺類抗生素與土壤脲酶結(jié)合生成的氫鍵作用、離子鍵作用對(duì)毒物毒性無(wú)明顯的影響(阿奇霉素涉及的O~(4B)→Asp_(329)、O~(13)→Asp_(394)、C~(8A)→Glu_5、O~(2A)→Glu_5氫鍵作用和N~1-Glu_(45)、N~1-Asp_(258)離子鍵作用與毒物毒性變化有一定的的相關(guān)性)。
【圖文】：

www.rcsb.org/pdb/home/home.do）[66]，PDB 代碼為 1FWJ。利用 MO 種樣品抗生素與土壤脲酶進(jìn)行分子對(duì)接。分子孔洞技術(shù)（圖 2-2）： 軟件及土壤脲酶。②MOE 界面，，點(diǎn)擊右側(cè) QuickPrep/Minimied。③。MOE 界面，Compute-Site Finder...-Apply-選中合適的對(duì)接區(qū)域（10 條鏈）-Dummies-Yes-Close。④導(dǎo)入小分子。MOE 界面，F(xiàn)ile-Ope分子)-選中小分子。⑤對(duì)接。Compute-Dock...。分別得到 20 種樣品脲酶的結(jié)合物。（在對(duì)接過(guò)程中，系統(tǒng)一般會(huì)自動(dòng)篩選出對(duì)接最優(yōu)可以通過(guò)對(duì)比分析每個(gè)結(jié)合物的相關(guān)參數(shù)來(lái)確定抗生素與土壤脲酶域。）

of quinolones antibiotic - soil urease complex at different化活性中心面積占比催化活性中心結(jié)合面積占比非催化活性中心能量變化催化活心能量38% 55% -8.57534 -10.33% 52% -9.008 -11.132% 53% -10.46236 -13.128% 43% -7.60236 -10.3示，諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星鍵、離子鍵的作用為主，運(yùn)用 MOE 軟件的分子生素與土壤脲酶相互作用后的能量變化、結(jié)合面子鍵等作為評(píng)價(jià)諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星作用的重要參數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X171.5

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本文編號(hào)：2675834