【摘要】：青藏高原是世界上最高的高原,素有世界屋脊之稱。高原環(huán)境具有低氧、低溫及強紫外線等特點,對動物來講是一種挑戰(zhàn)。世居高原的動物經(jīng)過自然選擇,從表型到遺傳,從生理到分子機制,已經(jīng)進化出各自獨特的高原適應機制。鬣蜥科沙蜥屬青藏高原特有物種青海沙蜥(Phrynocephalus vlangalii),經(jīng)過世代演變,已經(jīng)很好地適應了高原環(huán)境。本研究中,我們以世居高原的青海沙蜥瑪多種群(4270米)和德令哈種群(2862米)為研究對象,利用RNA測序技術對青海沙蜥瑪多和德令哈種群的不同發(fā)育階段(幼體和成體)進行了種群間和發(fā)育階段間的比較轉(zhuǎn)錄組學研究,篩選差異表達基因(DEGs)并進行GO和KEGG的功能注釋分析,尋找關鍵的代謝通路及調(diào)控基因,并進行生理生化層面的驗證,以期更為深入地探究爬行動物的高原適應性及其調(diào)控機制。對青海沙蜥成體和幼體高低海拔種群共計12個樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序、組裝及過濾后,共獲得84.05Gb Clean data,Q30堿基百分比在90.64%及以上;經(jīng)Trinity合并組裝后共獲得96348條Unigene,其中N50為1852bp;對Unigene進行功能注釋,包括與NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫的比對,共獲得19947條Unigene的注釋結果。將四組樣品分別進行成對比較,以FDR0.01且FC≥2為標準篩選樣品間DEGs,探索基因的表達模式并進行功能注釋和代謝通路的分析。采用生理生化的方法對能量代謝的關鍵代謝酶和物質(zhì)進行了測定,結合轉(zhuǎn)錄組與生理生化的方法探究青海沙蜥不同種群及不同發(fā)育階段的高原適應性。在幼體階段,我們發(fā)現(xiàn)有688條基因在德令哈種群與瑪多種群間存在差異,這些DEGs被注釋到60個GO條目中,并在分子伴侶依賴的蛋白質(zhì)折疊(GO:0051085)、氧氣結合(GO:0019825)、氧化應激響應(GO:0006979)以及ATP分解(GO:0006200)等條目中得到顯著富集。DEGs共涉及78條KEGG代謝通路,經(jīng)富集分析后篩選出一條富集代謝通路即脂肪酸代謝通路(ko01212)。其中參與脂肪酸合成的基因(如ACC2和SCD)在瑪多種群中顯著上調(diào),參與脂肪酸氧化的基因(如CPT1)顯著下調(diào)。代謝酶活性與物質(zhì)含量測定的結果顯示瑪多種群具有較低的HOAD的活性及較高的總膽固醇含量。轉(zhuǎn)錄組與酶活性的實驗結果說明高海拔的青海沙蜥幼體更傾向于脂肪的合成與貯存。在成體階段,我們發(fā)現(xiàn)有2223條基因在德令哈和瑪多種群間存在差異,這些基因被注釋到54個GO條目中,其中ERK1和ERK2級聯(lián)調(diào)節(jié)過程(GO:0070372)、電子載體活性(GO:0009055)及血紅素結合(GO:0020037)等條目得到顯著富集。這些DEGs共涉及185條KEGG代謝通路,其中神經(jīng)活動配體受體相互作用(ko04080)及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(ko00400)等通路的富集程度較高。參與脂肪酸降解(如ACAT2與AOX1)和氨基酸生物合成(TAT、ARG2及ASS1)等代謝通路的基因在高海拔種群中表達量上調(diào);酶活性測定的結果顯示高海拔種群具有較高的LDH和HOAD活性。這些結果表明高海拔的成體青海沙蜥更傾向于脂肪酸的分解來供能,這與唐曉龍等人在紅尾沙蜥(Phrynocephalus erythrurus)和青海沙蜥中得到結果一致,提示上述特性可能在高原幾種沙蜥中廣泛存在。在德令哈種群中,成體和幼體共有1069條DEGs,這些基因被注釋到41個GO條目中,其中免疫系統(tǒng)過程(GO:0002376)、細胞生長(GO:0016049)、補體激活途徑(GO:0006957和GO:0006958)等條目得到顯著富集。這些DEGs共涉及215條KEGG的代謝途徑,其中礦物質(zhì)吸收(ko04978)、溶酶體(ko04145)及氧化磷酸化(ko00190)等通路的富集程度較高。成體中脂肪酸合成相關的基因(ACC1、FAD6和SCD)的表達量上調(diào),脂肪酸氧化相關的基因(CPTIB和ACAT1)的表達量下調(diào),說明德令哈種群成體更傾向于脂肪的合成和積累;成體還上調(diào)了免疫系統(tǒng)過程相關的大部分基因,這種免疫系統(tǒng)的增強能夠有效地防止微生物的侵害,更好地適應棲息地的復雜環(huán)境。在瑪多種群中,成體和幼體間共有3019條DEGs,注釋到GO的48個條目中,在糖酵解過程(GO:0006096)、免疫系統(tǒng)過程(GO:0002376)和生長因子活性(GO:0008083)條目得到富集;這些DEGs參與KEGG的184條代謝通路,其中氧化磷酸化(ko00190)、類固醇的生物合成(ko00100)和心肌收縮(ko04260)三條通路得到顯著富集。與幼體相比,成體中脂肪酸合成的基因(FAD、ACC2、ACSL3及ELOVL等)的表達量下調(diào),脂肪酸氧化的大部分基因(KCS及AOX1)的表達量上調(diào)。此外,成體還下調(diào)了氧化磷酸化(ND、NDUFS、SDHUFS2和COX等)和糖酵解(LDHA、LDHB和GAPDH等)相關基因的表達量,表明在發(fā)育中機體下調(diào)了氧化磷酸化和糖酵解的水平。這些結果表明與幼體相比,瑪多種群在幼體到成體的發(fā)育過程中伴隨著代謝底物偏好向脂肪酸的轉(zhuǎn)化。我們還對青海沙蜥瑪多種群冬眠前期、冬眠中期和冬眠覺醒期三個時期肝臟中的轉(zhuǎn)錄組進行了比較分析,篩選DEGs并進行聚類分析,篩選參與冬眠低溫調(diào)控的關鍵代謝通路。轉(zhuǎn)錄組測定及過濾后共得到41.41Gb Clean data,Q30在94.48%及以上;經(jīng)Trinity合并組裝后共獲得192696條Unigene;比對到七大數(shù)據(jù)庫后,共得到26566條Unigene的注釋結果;將三組樣品進行兩兩配對比較,以FDR0.01且FC≥2為標準篩選DEGs,并進行基因功能的注釋分析。結果顯示,與其它兩組相比,冬眠期青海沙蜥與脂肪酸代謝(ko01212)有關的基因都顯著上調(diào),而氧化磷酸化(ko00190)和糖酵解過程(ko00010)的大部分基因顯著上調(diào),提示其在冬眠過程中主要通過脂肪酸氧化的方式提供能量,這與馬鐵菊頭蝠的冬眠的研究結果一致。青海沙蜥冬眠期還上調(diào)了免疫響應相關的基因(IL8、CXCL1及FHC)表達,保護機體免受細菌病毒的感染。同時還發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽代謝(ko00480)通路中相關基因(GST和PHGSH-Px)在冬眠期也表達量上調(diào),以避免氧化應激損傷。上述結果提示,青海沙蜥在冬眠階段通過代謝、免疫與抗氧化防御等方面的調(diào)節(jié),更好耐受并適應了冬眠期間的低溫等極端環(huán)境。本論文從轉(zhuǎn)錄組學的角度闡明了青海沙蜥的高原適應和冬眠期低溫適應方面的基因表達情況,篩選到了代謝、免疫及生長相關的關鍵基因和代謝調(diào)控通路,為后期生理生化角度的驗證提供了參考和依據(jù);另一方面豐富了青海沙蜥不同發(fā)育階段及不同生理狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源,為后期的大規(guī)模數(shù)據(jù)分析提供了參考和利用信息。
【圖文】：

26圖 2.1. 青海沙蜥轉(zhuǎn)錄組樣品組裝后 Unigene 長度分布re 2.1. The length distribution of assembled unigenes in P. vla

3 青海沙蜥德令哈和瑪多幼體種群間差異表達基因的火山圖（A）和 MA 圖（點代表一個基因，紅色的點代表上調(diào)基因，綠色的點代表下調(diào)基因，黑色的差異基因。A 圖的橫坐標：log2(FC)，，即兩樣品間基因表達量差異倍數(shù)的對數(shù)：-log10(FDR)，即錯誤發(fā)現(xiàn)率的負絕對值；B 圖橫坐標：log2(FPKM)，即樣品均值的對數(shù)值；縱坐標為：log2(FC)，即兩樣品間基因表達量差異倍數(shù)的對數(shù) 2.3 Volcanno plot (A) and MA plot (B) of DEGs between the population of Delin
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q953

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本文編號：2675576