【摘要】：細(xì)胞自噬既可以清除細(xì)胞內(nèi)“廢物”,也為細(xì)胞更新和穩(wěn)態(tài)維持提供了物質(zhì)和能量保障。蛋白聚集體自噬和脂滴自噬的異常與多種人類疾病相關(guān),但其作用機(jī)制仍不清楚。本篇論文圍繞兩種選擇性自噬展開(kāi),分為兩個(gè)部分。論文第一部分揭示了線粒體蛋白運(yùn)輸調(diào)控胞質(zhì)中蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),線粒體外膜蛋白運(yùn)輸復(fù)合物的重要組成成份Tom40表達(dá)水平下降后,胞質(zhì)中蛋白酶體功能下降,自噬途徑出現(xiàn)異常。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量被自噬膜結(jié)構(gòu)包裹的蛋白聚集體。在神經(jīng)系統(tǒng)中,Tom40表達(dá)水平的減少也會(huì)引起泛素化的蛋白聚集體在神經(jīng)細(xì)胞中累積,并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的退化和損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Tom40表達(dá)水平的減少還會(huì)加劇亨廷頓疾病致病蛋白Htt polyQ的積累,加重神經(jīng)損傷,暗示線粒體蛋白運(yùn)輸系統(tǒng)的異常會(huì)進(jìn)一步加劇胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的累積和毒性。線粒體損傷和蛋白聚集體的累積是神經(jīng)退行性疾病的兩大特征,本研究揭示了二者之間的關(guān)系,加深了對(duì)神經(jīng)退行性疾病致病機(jī)制理解。在本論文第二部分的工作中,我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)果蠅突變體的眼中積累了大量脂滴,暗示其可能參與調(diào)控細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝。定位克隆發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的果蠅基因CG5745在這兩個(gè)突變體中發(fā)生了突變。CG5745編碼一個(gè)進(jìn)化上保守的含有Tre2-Bub2-Cdc16(TBC)結(jié)構(gòu)域的蛋白。我們根據(jù)其哺乳動(dòng)物同源基因TBC1D22A和TBC1D22B的名稱將其命名為dTBC22。含有TBC結(jié)構(gòu)域的蛋白通常作為GTPase激活蛋白(GAP)催化Rab蛋白水解GTP。我們發(fā)現(xiàn)dTBC22的GAP活性對(duì)其調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是十分重要的。表達(dá)顯性負(fù)性突變體(dominant negative)dTBC22RQ導(dǎo)致脂滴在多組織中積累。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)dTBC22與Rab40相互作用,發(fā)揮GAP活性促進(jìn)Rab40水解GTP。與dTBC22突變相似,過(guò)表達(dá)模擬GTP結(jié)合形式的Rab40突變體Rab40Q75L也會(huì)導(dǎo)致多種組織中脂滴的積累。Rab40敲除后,果蠅體重增加,耐饑餓能力增強(qiáng)。在果蠅脂肪體中,Rab40敲除抑制饑餓導(dǎo)致的脂滴減小。Rab40與脂滴上甘油三酯脂肪酶Brummer(Bmm)結(jié)合。在正常飼喂條件下,野生型的果蠅脂肪體中Bmm蛋白水平較低,Rab40缺失果蠅的脂肪體中Bmm蛋白水平升高,暗示Rab40在營(yíng)養(yǎng)充足條件下抑制Bmm水平。饑餓后,野生型的果蠅脂肪體中Bmm蛋白水平升高,此時(shí)Rab40缺失果蠅脂肪體中的Bmm蛋白水平與野生型相當(dāng),暗示饑餓解除了Rab40對(duì)Bmm水平的抑制。與此對(duì)應(yīng),我們發(fā)現(xiàn)Rab40在細(xì)胞中廣泛分布,營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)在脂滴上富集。但在饑餓條件下,脂滴上的Rab40消失,高爾基體上出現(xiàn)Rab40的富集。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),敲除Rab40會(huì)減少脂肪體中饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬囊泡分子標(biāo)記Atg8a和溶酶體膜蛋白LAMP在脂滴周?chē)木奂?暗示脂滴自噬出現(xiàn)異常。在脂肪體中敲減LAMP或Atg8a的表達(dá)均抑制饑餓誘導(dǎo)的脂滴減少,暗示Rab40可能通過(guò)調(diào)控脂滴的自噬調(diào)控胞內(nèi)脂代謝�；谝陨辖Y(jié)果,我們得出以下模型:營(yíng)養(yǎng)充足時(shí),Rab40在脂滴上富集,與Bmm結(jié)合,降低Bmm水平。饑餓時(shí),Rab40離開(kāi)脂滴,解除對(duì)Bmm的抑制,并促進(jìn)脂滴自噬,從而實(shí)現(xiàn)脂肪體中脂質(zhì)的調(diào)度和使用。dTBC22促進(jìn)Rab40水解GTP,使得Rab40可以在GTP和GDP結(jié)合形式之間循環(huán)互換,維持其正常功能。dTBC22的缺失或Rab40的過(guò)表達(dá)均打破了Rab40循環(huán),產(chǎn)生顯性負(fù)效應(yīng),抑制Rab40活性,破壞了脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。這一研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)調(diào)控脂質(zhì)代謝的新分子,加深了人們對(duì)脂解和脂滴自噬過(guò)程的認(rèn)識(shí)。
【圖文】：

所有的生物體內(nèi)都存在持續(xù)的更新，細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的組份通過(guò)不斷地重建和逡逑回收，用新鮮的、高質(zhì)量的組份替換舊組份，以維持細(xì)胞的正常的形態(tài)和功能。逡逑真核細(xì)胞的亞細(xì)胞降解系統(tǒng)主要有兩種，自噬－溶酶體系統(tǒng)和泛素－蛋白酶體系逡逑統(tǒng)。泛素－蛋白酶體的降解有較高的選擇性，它通常只識(shí)別泛素化底物，主要是一逡逑些短期存在的蛋白質(zhì)。相比之下，自噬－溶酶體系統(tǒng)有更廣泛的功能，它參與細(xì)胞逡逑適應(yīng)和重建，大分子的回收利用以及生物合成運(yùn)輸。溶酶體被稱為“細(xì)胞的垃圾逡逑桶”，它在細(xì)胞更新過(guò)程中起到非常重要的作用。細(xì)胞外的物質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白可以逡逑通過(guò)內(nèi)吞作用被運(yùn)送到溶酶體，細(xì)胞內(nèi)的組份（蛋白質(zhì)、脂類、糖原、細(xì)胞器）逡逑也可以通過(guò)自噬途徑被運(yùn)送到溶酶體。盡管自噬－溶酶體系統(tǒng)和泛素－蛋白酶體系統(tǒng)逡逑的活性不是相互依賴的，但最近有研究表明兩種降解系統(tǒng)間是存在聯(lián)系的，抑制逡逑其中一個(gè)，導(dǎo)致另一個(gè)互補(bǔ)性上調(diào)，為了維持穩(wěn)態(tài)，由于一個(gè)降解系統(tǒng)抑制引起逡逑的積累的細(xì)胞物質(zhì)需要被清理，這至少部分是由另外的降解系統(tǒng)完成的［１］（圖Ｕ）。逡逑

細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞中高度保守的過(guò)程，通過(guò)自噬途徑，胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)被逡逑運(yùn)送到動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體或植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞的液泡中。細(xì)胞自噬包括三種類逡逑型：巨自噬，微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（圖１．２）。雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡是巨逡逑自噬的形態(tài)學(xué)特征。巨自噬中，，胞質(zhì)中游離的膜結(jié)構(gòu)會(huì)包裹隔離胞質(zhì)的一小部分，逡逑包括可溶性物質(zhì)和細(xì)胞器，形成自噬泡。自噬泡會(huì)與溶酶體融合形成自噬溶酶體，逡逑其內(nèi)包裹的物質(zhì)會(huì)被溶酶體水解酶降解，降解產(chǎn)物（如氨基酸），可以被重復(fù)利用。逡逑在與溶酶體融合之前，自嗟泡也可以先與內(nèi)吞體、多泡體（ｍｕｌｔｉ－ｖｅｓｉｃｕｌａｒ邋ｂｏｄｉｅｓ，逡逑ＭＶＢｓ）融合，形成自喔內(nèi)涵體（ａｍｐｈｉｓｏｍｅ）。逡逑Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ邐Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ邐Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ逡逑ａｕｔｏｐｈａｇｙ逡逑｜邋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邐Ｈｓｃ７０邋＆逡逑ｃｏｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ逡逑ｉｓｏｌａｔｉｏｎ＾＾＾逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑ｉ邐？逡逑Ｌ邋…ｉ逡逑一＾Ｌａｍｐ－２Ａ邐－－ｒｒ逡逑（0＼邋ｍＭ逡逑Ｉ邐，逡逑Ｔ邐｜逡逑Ａ邋ｒ，0＼ｙｔ：邋：邋Ｏｆｉｎ；逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑■邋Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q25

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本文編號(hào)：2674478