【摘要】：RNA干擾(RNA interference,RNAi)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制,可靶向mRNA進行剪切降解從而發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。siRNA(small interference RNA)因其高效性和特異性而被廣泛應(yīng)用于藥物研究中。目前,研究者們已開發(fā)了多種陽離子載體用于siRNA遞送。但由于siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)具有相對較強的剛性結(jié)構(gòu),且陰離子電荷密度較低,無法與陽離子載體形成穩(wěn)定、致密的復(fù)合物,使得siRNA的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn),如細胞攝取率低、靶向特異性差、遞送過程不穩(wěn)定、潛在的細胞毒性以及易誘發(fā)免疫反應(yīng)等。近年來,核酸自組裝納米結(jié)構(gòu)由于其結(jié)構(gòu)靈活且負電荷密度較高而受到廣泛關(guān)注,有望實現(xiàn)siRNA藥物的高效遞送和基因沉默。本文致力于開發(fā)一種新的轉(zhuǎn)錄模板來構(gòu)建核酸自組裝納米微球,并對納米微球的結(jié)構(gòu)特征、細胞攝取以及基因調(diào)控功能進行研究。(1)本研究設(shè)計并合成了啞鈴型環(huán)狀DNA模板,利用滾環(huán)轉(zhuǎn)錄(rolling circle transcription,RCT)技術(shù),合成poly-RNA。通過堿基互補配對,poly-RNA進一步自組裝,并與轉(zhuǎn)錄過程中形成的焦磷酸鎂晶體結(jié)合,形成海綿狀RNA納米微球(RNA nanoparticles,RNP)。瓊脂糖凝膠電泳分析實驗初步驗證了poly-RNA的形成。(2)本研究對納米微球的組成、粒徑、表面電勢、結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性等進行了一系列表征。納米微球呈海綿微孔球狀結(jié)構(gòu)。粒子大小與轉(zhuǎn)錄過程中的Mg~(2+)濃度有關(guān),Mg~(2+)濃度由6 mM提高至15 mM時,納米微球的粒徑由2μm~3.5μm降至1μm左右。根據(jù)Zeta電位測量結(jié)果,納米微球的表面電勢為-12~-14 mV。血清穩(wěn)定性實驗表明相比天然的siRNA,納米微球具有更好的穩(wěn)定性。隨著時間的延長,對照組siRNA在6小時內(nèi)降解到20%左右,24小時內(nèi)幾乎降解完全,而RNP降解速度相對于siRNA更慢,24小時后仍有40%未被降解。(3)siRNA的細胞攝取與溶酶體逃逸過程是其發(fā)揮有效的基因沉默調(diào)控的關(guān)鍵過程。因此,本課題研究了HepG2細胞對納米微球的攝取過程,以及納米微球進入細胞后的溶酶體逃逸過程。相比天然的siRNA,納米微球的細胞攝取效率更高,且在轉(zhuǎn)染12小時后能夠從溶酶體中逃逸出來。最后我們證實了納米微球?qū)崿F(xiàn)了對綠色熒光蛋白基因的表達沉默調(diào)控。
【圖文】：

圖 1.1 siRNA 作用機制[14]naute (Ago)蛋白在 RNA 干擾過程中起著非常重要的作用，，Ag子質(zhì)量約為十萬的結(jié)構(gòu)高度保守的堿性蛋白家族。人類體內(nèi)表go3 和 Ago4 四個亞型，在哺乳動物體內(nèi)只有 Ago2 具有核酸內(nèi)擾過程中起著重要作用[15]。如圖 1.2 所示，Ago2 基本結(jié)構(gòu)模N 末端和 MID 結(jié)構(gòu)域組成新月形的底座，PAZ 結(jié)構(gòu)域由莖狀結(jié)的上方[16]。PIWI 由 300 個非常保守的氨基酸構(gòu)成，含有類似 R，負責(zé)剪切靶向 mRNA[17]。PAZ 區(qū)域是一個疏水區(qū)域，依靠氫NA 結(jié)合，能夠識別 siRNA 的 3′末端懸垂，決定了 RNA 誘導(dǎo)induced silencing complex, RISC)的向?qū)Чδ躘18]。N-lobe 則是作旋和 RISC 激活中發(fā)揮重要作用[19]。MID 結(jié)構(gòu)域能夠使 Ag 7-甲基鳥嘌呤結(jié)合，從而抑制 mRNA 的轉(zhuǎn)錄起始[20]。

圖 1.1 siRNA 作用機制[14] (Ago)蛋白在 RNA 干擾過程中起著非常重要的作用約為十萬的結(jié)構(gòu)高度保守的堿性蛋白家族。人類體 Ago4 四個亞型，在哺乳動物體內(nèi)只有 Ago2 具有核程中起著重要作用[15]。如圖 1.2 所示，Ago2 基本結(jié)和 MID 結(jié)構(gòu)域組成新月形的底座，PAZ 結(jié)構(gòu)域由[16]。PIWI 由 300 個非常保守的氨基酸構(gòu)成，含有剪切靶向 mRNA[17]。PAZ 區(qū)域是一個疏水區(qū)域，合，能夠識別 siRNA 的 3′末端懸垂，決定了 RNd silencing complex, RISC)的向?qū)Чδ躘18]。N-lobe 則RISC 激活中發(fā)揮重要作用[19]。MID 結(jié)構(gòu)域能夠基鳥嘌呤結(jié)合，從而抑制 mRNA 的轉(zhuǎn)錄起始[20]。
【學(xué)位授予單位】：齊魯工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2670118