【摘要】：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans NG)合成并分泌普魯蘭多糖,普魯蘭多糖合成的分子機制尚不清楚。本試驗的目的是尋找出芽短梗霉中普魯蘭多糖合成途徑中的關鍵基因,初步探索普魯蘭多糖的合成機制。前期研究通過轉錄組數據推測15個糖代謝基因可能和普魯蘭多糖合成相關。本試驗利用實時定量PCR對這些基因的轉錄水平進行檢測,檢測結果與轉錄組測定數據一致,證明了轉錄組數據可靠性。本研究檢測了出芽短梗霉發(fā)酵過程中菌體生物量、胞內糖原、胞外普魯蘭多糖含量、15個候選基因轉錄水平的變化規(guī)律。對基因comp1961進行生物信息學分析和結構預測,構建工程菌pPIC9K-1961/GS115,在畢赤酵母中進行異源表達。結果如下:(1)在YPD培養(yǎng)基中,出芽短梗霉生長迅速并且在第3天達到了最大值,隨后菌體生物量逐漸降低并在后期趨于平穩(wěn);普魯蘭多糖的含量在第5天達了到最大值,隨后含量逐漸降低;細胞內糖原含量在第二天最高然后逐漸降低,細胞內糖原含量和普魯蘭多糖含量呈負相關,推測糖原的合成可能和普魯蘭多糖的合成相關。(2)在高產糖培養(yǎng)基YPD的培養(yǎng)條件下,利用實時定量PCR對出芽短梗霉中這15個基因在不同培養(yǎng)時間點的轉錄水平進行檢測,從而分析這15個基因和普魯蘭多糖合成的關系。實時定量結果發(fā)現(xiàn)基因代碼為comp3609,comp9920,comp9549,comp7480,comp3824,comp3260,comp1482的表達量在整個過程中相對較低,基因代碼為comp9219,comp1961的表達量相對較高,基因代碼為comp7877,comp7023,comp7120,comp6817,comp5441的基因在36-72 h間表達量較高,基因代碼為comp4798的基因在72 h后表達量較高。(3)生物信息學軟件預測該蛋白是親水性蛋白,具有α-淀粉酶結構域。根據轉錄組中相關序列信息擴增comp1961基因,成功構建克隆及表達載體,通過SDS-PAGE和Western Blot驗證重組蛋白在畢赤酵母中成功表達,經檢測目的蛋白不能水解淀粉或糖原。研究發(fā)現(xiàn)將α-淀粉酶在普魯蘭多糖合成過程中發(fā)揮重要作用,本實驗室在進行轉錄組數據分析時發(fā)現(xiàn)comp1961的表達量顯著上調,推測comp1961在普魯蘭多糖的合成發(fā)揮著重要作用。通過體外克隆表達comp1961基因并成功表達,但是體外并沒有檢測到淀粉酶活性。本研究結合前人的研究和轉錄組數據分析,提出一種可能的普魯蘭多糖合成途徑。但是體外驗證酶活性卻未成功,下一步欲利用基因敲除的方法將comp1961基因敲除,檢測胞內糖原的含量和胞外普魯蘭多糖的產量,以驗證推論是否正確。
【圖文】：

5個候

3 comp7480 comp787719 comp9549 comp9920圖 2-1 15 個候選基因的熔解曲線Fig. 2-1 The melt curve of 15 candidate genes實時定量結果
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q93;Q78

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王青艷;申乃坤;朱婧;秦艷;朱綺霞;謝能中;李億;黃日波;;新型Ⅰ型普魯蘭酶基因的克隆表達及酶學性質[J];廣西科學院學報;2016年02期

2 王兵波;沈微;錢靈紫;李琛;羅梟;樊游;陳獻忠;;一種密碼子優(yōu)化的酸性普魯蘭酶基因在巴斯德畢赤酵母中的高效表達[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2016年07期

3 孫曉晨;初曉宇;伍寧豐;;細菌Ⅰ型普魯蘭酶的研究進展[J];中國農業(yè)科技導報;2012年02期

4 陸健,金沖,顧國賢;普魯蘭酶及其生產菌種[J];釀酒;1998年05期

5 金潰斯�，，聺�

本文編號：2666123