發(fā)布時(shí)間：2020-05-16 03:49

【摘要】：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans NG)合成并分泌普魯蘭多糖,普魯蘭多糖合成的分子機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)的目的是尋找出芽短梗霉中普魯蘭多糖合成途徑中的關(guān)鍵基因,初步探索普魯蘭多糖的合成機(jī)制。前期研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測(cè)15個(gè)糖代謝基因可能和普魯蘭多糖合成相關(guān)。本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)定數(shù)據(jù)一致,證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性。本研究檢測(cè)了出芽短梗霉發(fā)酵過(guò)程中菌體生物量、胞內(nèi)糖原、胞外普魯蘭多糖含量、15個(gè)候選基因轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。對(duì)基因comp1961進(jìn)行生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),構(gòu)建工程菌pPIC9K-1961/GS115,在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果如下:(1)在YPD培養(yǎng)基中,出芽短梗霉生長(zhǎng)迅速并且在第3天達(dá)到了最大值,隨后菌體生物量逐漸降低并在后期趨于平穩(wěn);普魯蘭多糖的含量在第5天達(dá)了到最大值,隨后含量逐漸降低;細(xì)胞內(nèi)糖原含量在第二天最高然后逐漸降低,細(xì)胞內(nèi)糖原含量和普魯蘭多糖含量呈負(fù)相關(guān),推測(cè)糖原的合成可能和普魯蘭多糖的合成相關(guān)。(2)在高產(chǎn)糖培養(yǎng)基YPD的培養(yǎng)條件下,利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)出芽短梗霉中這15個(gè)基因在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),從而分析這15個(gè)基因和普魯蘭多糖合成的關(guān)系。實(shí)時(shí)定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因代碼為comp3609,comp9920,comp9549,comp7480,comp3824,comp3260,comp1482的表達(dá)量在整個(gè)過(guò)程中相對(duì)較低,基因代碼為comp9219,comp1961的表達(dá)量相對(duì)較高,基因代碼為comp7877,comp7023,comp7120,comp6817,comp5441的基因在36-72 h間表達(dá)量較高,基因代碼為comp4798的基因在72 h后表達(dá)量較高。(3)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)該蛋白是親水性蛋白,具有α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中相關(guān)序列信息擴(kuò)增comp1961基因,成功構(gòu)建克隆及表達(dá)載體,通過(guò)SDS-PAGE和Western Blot驗(yàn)證重組蛋白在畢赤酵母中成功表達(dá),經(jīng)檢測(cè)目的蛋白不能水解淀粉或糖原。研究發(fā)現(xiàn)將α-淀粉酶在普魯蘭多糖合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用,本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)comp1961的表達(dá)量顯著上調(diào),推測(cè)comp1961在普魯蘭多糖的合成發(fā)揮著重要作用。通過(guò)體外克隆表達(dá)comp1961基因并成功表達(dá),但是體外并沒(méi)有檢測(cè)到淀粉酶活性。本研究結(jié)合前人的研究和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,提出一種可能的普魯蘭多糖合成途徑。但是體外驗(yàn)證酶活性卻未成功,下一步欲利用基因敲除的方法將comp1961基因敲除,檢測(cè)胞內(nèi)糖原的含量和胞外普魯蘭多糖的產(chǎn)量,以驗(yàn)證推論是否正確。
【圖文】：

5個(gè)候

3 comp7480 comp787719 comp9549 comp9920圖 2-1 15 個(gè)候選基因的熔解曲線Fig. 2-1 The melt curve of 15 candidate genes實(shí)時(shí)定量結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q93;Q78

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4 陸健,金沖,顧國(guó)賢;普魯蘭酶及其生產(chǎn)菌種[J];釀酒;1998年05期

5 金潰斯停�，聺�

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