【摘要】：食欲肽(Orexins)包括食欲肽 A(Orexin A,OXA)和食欲肽 B(Orexin B,OXB),是一種主要由下丘腦和下丘腦外側(cè)中樞神經(jīng)元合成的神經(jīng)肽。其與食欲肽受體1(Orexin 1 receptor,OX1R)和食欲肽受體2(Orexin2 receptor,OX2R)發(fā)生結(jié)合參與調(diào)控?cái)z食、睡眠與覺醒、能量代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)等活動(dòng)。然而目前,關(guān)于食欲肽及食欲肽受體的研究主要集中在人上,關(guān)于豬OX2R(pOX2R)以及其突變型的生理活性的研究較少。為了更進(jìn)一步的研究pOX2R的生理功能,了解配體作用受體后胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性,進(jìn)而為育種優(yōu)化等提供依據(jù),本研究以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT質(zhì)粒為模板,根據(jù)已有文獻(xiàn)中基因多態(tài)性與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系選擇了 P10S、P11T、V3081和T401I四個(gè)突變體;利用單點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建四個(gè)突變體的真核表達(dá)載體,再將pOX2R突變體真核表達(dá)載體與野生型(Wild type,WT)真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,Western blot技術(shù)驗(yàn)證其是否能在體外細(xì)胞中正常表達(dá);利用雙報(bào)告基因法檢測(cè)WT與突變體在不同濃度配體刺激下胞內(nèi)總環(huán)磷酸酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)白的表達(dá)水平;利用Western blot的方法評(píng)價(jià)高濃度激動(dòng)劑下對(duì)WT與突變體下游磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 1/2(Phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)、磷酸化p38和磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Phosphorylated cAMP-response element bindingprotein,p-CREB)的表達(dá)的影響,以此研究pOX2R的生理功能。主要研究結(jié)果如下:1、以構(gòu)建好的pOX2R WT真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-WT為模板,利用定點(diǎn)突變技術(shù)成功構(gòu)建四個(gè)突變體。將構(gòu)建好的四種突變體分別命名為pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P10S、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-P11T、pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R-V308I 和pcDN A3.1(+)-myc/pOX2 R-T401I。2、將構(gòu)建好的突變體與WT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后24 h提取細(xì)胞總蛋白,利用Western blot技術(shù)驗(yàn)證其在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示,pOX2R的WT與四個(gè)突變體在細(xì)胞中均能夠順利表達(dá)。3、將pOX2R WT與四個(gè)突變體真核表達(dá)載體分別與螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pRL-TK按照2:10:1的比例共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平。結(jié)果顯示四個(gè)突變體的胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平與WT相比無(wú)顯著差異。采用不同濃度(10-6M-10-10M)的OXA和OXB分別對(duì)表達(dá)WT和四個(gè)突變體pOX2R的細(xì)胞進(jìn)行刺激。研究結(jié)果表明,不管是pOX2R WT還是突變體,胞內(nèi)的cAMP水平呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。相比于WT,突變體P10S、P11T和T401I對(duì)相同濃度激動(dòng)劑OXA的響應(yīng)顯著下降。在相同濃度激動(dòng)劑OXB刺激下,只有突變體P11T與WT相比靈敏度顯著降低。上述結(jié)果表明,第10、11和401位氨基酸的突變均能對(duì)胞內(nèi)的PKA通路產(chǎn)生影響。4、將pOX2R WT與突變體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,10-6 M OXB和10-7 M OXA分別進(jìn)行刺激,提取總蛋白,利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)p-ERK1/2、p-p38和p-CREB的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,在OXA和OXB誘導(dǎo)下,四個(gè)突變體胞內(nèi)p-CREB表達(dá)水平與WT相比均顯著下降;與WT相比,在OXA的刺激下,突變體V3081的p-ERK1/2顯著降低,突變體P10S、P11T和V308I的p38磷酸化水平顯著降低;在配體OXB誘導(dǎo)下,突變體T401I胞內(nèi)p-ERK/2水平顯著降低,突變體P11T的p-p38水平顯著降低。上述結(jié)果表明,這四個(gè)位點(diǎn)的突變能對(duì)PKC及MAPK通路產(chǎn)生影響。
【圖文】：

１．３．２支架蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)逡逑ＧＰＣＲ信號(hào)支架蛋白也是ＧＰＣＲ信號(hào)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部分，可以參與更加復(fù)雜高級(jí)的信號(hào)逡逑轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖１．１）。ＧＰＣＲ支架蛋白主要分為三類，第一種是含有ＰＤＺ結(jié)構(gòu)域支架蛋白，它能逡逑與ＧＰＣＲ胞內(nèi)的羧基端結(jié)合，將ＧＰＣＲ與各種激酶（ＰＫＣ，ＰＬＣ），離子通道偶聯(lián)。逡逑第二種是非ＰＤＺ結(jié)構(gòu)域支架蛋白，包括Ａ型激酶錨定蛋白，ＰＫＡ等，能調(diào)節(jié)ＧＰＣＲ逡逑信號(hào)。逡逑最后一種是抑制蛋白，如ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎｓ。目前，與ＧＰＣＲ相互作用的蛋白中研究最多的逡逑就是抑制蛋白，它可以作為ＧＰＣＲ信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，使得活化的受體與Ｇ蛋白解離逡逑（信號(hào)傳導(dǎo)脫敏）或介導(dǎo)ＧＰＣＲ內(nèi)化，亦能直接以一種不依賴Ｇ蛋白的形式介導(dǎo)ＧＰＣＲ與逡逑胞內(nèi)信號(hào)分子之間的作用［３６］。逡逑

兩種食欲肽和兩種受體亞型的存在必然會(huì)使得細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有多樣性。ＯＸＡ或逡逑ＯＸＢ與０Ｘ１Ｒ或０Ｘ２Ｒ的結(jié)合能夠同時(shí)激活Ｇｑ，Ｇ＃ＧＳ這三種亞基，其隨后誘導(dǎo)ＰＬＣ，逡逑ＰＬＡ，ＰＬＤ或ＡＣ的活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ｃａ２＋增加和下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖１．４）邋［４７，６比之前逡逑的觀點(diǎn)認(rèn)為鈣離子水平的變化主要由ＧＰＣＲ介導(dǎo)，，而現(xiàn)有的研究表明ＯＸＲ活化后，作用逡逑于非選擇性的陽(yáng)離子通道（ＮＳＣＣ）使得鈣離子水平升高［６２，６３］。研宄表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)逡逑中，食欲肽受體活化后激活非選擇性陽(yáng)離子通道，抑制鉀離子通道和使得鈉鈣離子發(fā)生交逡逑換，產(chǎn)生神經(jīng)興奮，也可通過突觸前作用刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放并調(diào)節(jié)突觸ｔ６４，６５］。食欲肽的逡逑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還涉及到外周如脂肪組織，腸神經(jīng)系統(tǒng)，腎上腺和胰腺。體外研宄表明，食欲肽逡逑增加粘膜下神經(jīng)叢的運(yùn)動(dòng)，可能通過Ｇｓ／ｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ級(jí)聯(lián)引起ｐ－ＣＲＥＢ的上調(diào)，亦能通過逡逑ｐ３８邋ＭＡＰＫ信號(hào)影響前脂肪細(xì)胞的分化過程。逡逑Ｐｕｔｕｌａ等人探索了表達(dá)０Ｘ１Ｒ的ＨＥＫ２９３細(xì)胞和Ｎｅｕｒｏ－２ａ細(xì)胞中食欲肽刺激受體后產(chǎn)逡逑生的信號(hào)傳導(dǎo)［４７］。結(jié)果表明，ＯＸＡ刺激０Ｘ１Ｒ后，釋放２－花生四烯酸，以時(shí)間依賴性和逡逑濃度依賴性活化ｐ３８和ＥＲＫ１／２
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2666042