【摘要】：BCAP又名PI3KAP1(phosphoinositide-3-kinase adaptor protein 1),BCAP含有四個YxxM基序。當(dāng)B細(xì)胞受體(BCR)信號啟動后,YxxM基序上的Tyr磷酸化可以募集到磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的P85α亞基并激活PI3K,活化的PI3K可以介導(dǎo)其下游激酶Akt磷酸化,進(jìn)而入核調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),并最終參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖,存活,代謝,細(xì)胞骨架重組與膜運(yùn)輸。七鰓鰻是具有很高研究價值的模式生物,因為它是在進(jìn)化上聯(lián)系脊椎動物和無脊椎動物的最原始的無頜類脊椎動物代表。在無頜類脊椎動物中是否存在BCAP以及功能如何尚無人報道。本研究在日本七鰓鰻(Lampetra japonica)中首次發(fā)現(xiàn)了BCAP基因,并采用嵌套PCR擴(kuò)增技術(shù)用高保真酶對BCAP基因的cDNA進(jìn)行了分子克隆。日本七鰓鰻BCAP分子(Lja-BCAP)開放閱讀框的長度為2181bp,編碼含有726個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。通過對不同脊椎動物BCAP的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),無頜類脊椎動物日本七鰓鰻原始類型的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中也存在BCAP。為了更深入明確其進(jìn)化關(guān)系,通過構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),雖然與高等脊椎動物遺傳距離較遠(yuǎn),但BCAP在無頜類脊椎動物中已經(jīng)進(jìn)化出現(xiàn)。為了進(jìn)一步了解Lja-BCAP在免疫調(diào)節(jié)中的作用,我們制備了Lja-BCAP兔源多克隆抗體。首先構(gòu)建了pET-32a(+)-Lja-BCAP重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli Rosetta表達(dá)菌誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并進(jìn)行了純化,以純化后的重組蛋白作為抗原免疫刺激新西蘭兔(Oryctolagus cuniculus)制備兔源多克隆抗體,采用耳動脈取血的方式抽取血液制備抗血清,并將抗血清分離并純化,得到了特異性較好的Lja-BCAP兔源多克隆抗體。利用siRNA干擾技術(shù)對Lja-BCAP分子的mRNA進(jìn)行了體內(nèi)干擾敲低實(shí)驗。在核酸和蛋白水平上檢測的結(jié)果表明:在注射了所設(shè)計的3組siRNA混合庫以后又免疫刺激日本七鰓鰻單個核白細(xì)胞和髓樣小體,Lja-BCAP分子的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平均能在隨后的12-36h內(nèi)被有效敲低。此結(jié)果為后續(xù)深入探索Lja-BCAP分子的功能奠定基礎(chǔ)。通過反轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot實(shí)驗檢測經(jīng)PHA免疫處理后Lja-BCAP在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上的相對表達(dá)量,結(jié)果表明,在免疫處理前Lja-BCAP的mRNA在單個核白細(xì)胞、鰓組織和髓樣小體中均有表達(dá),并且在單個核白細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于其它兩個組織。Lja-BCAP在單個核白細(xì)胞中其mRNA水平和蛋白水平在PHA免疫處理后36h表達(dá)量呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明,Lja-BCAP可能參與了日本七鰓鰻VLRB~+淋巴細(xì)胞(類B細(xì)胞)的免疫應(yīng)答過程,我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究BCAP分子在日本七鰓鰻淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2.4 髓樣小體總 RNA 的提取結(jié)果及反轉(zhuǎn)錄后的模板檢驗：DL2000 Marker；1、2 泳道均為髓樣小體總 RNA（B）M：DL2000 Marker；1：gapdh.4 Total RNA electrophoretogram of supraneural myeloid body and template test after transcription(A)M:DL2000 Marker;1,2: Supraneural myeloid body total RNA(B)M:DL2000 MarkeHousekeeping gene gapdh

圖 2.5 Lja-BCAP 基因的 ORF 區(qū)克��；（A）M：DL5000 Marker；1：BCAP 基因的 PCR 產(chǎn)物；（B）M：DL5000 Marker；1：BCAP 基因的嵌套 PCR 產(chǎn)物；（C）M：DL5000 Marker；1：目的基因的膠回收；（D）M：DL5000 Marker；1:連接轉(zhuǎn)化后菌液 PCR 產(chǎn)物；（E）M：DL5000 Marker；1：連接目的基因的質(zhì)粒；Fig. 2.5 Lja-BCAP ORF gene clone(A)M:DL5000 Marker;1: BCAP PCR products; (B)M:DL5000 Marker;1: BCAP Nested PCR products;(C)M:DL5000 Marker;1: BCAP gel recycling products;(D)M:DL5000 Marker;1: colony PCRproducts;(E)M:DL5000 Marker;1: BCAP plamid
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2662099