發(fā)布時間：2020-05-13 13:47

【摘要】：微生物對有機溶劑的耐受能力在許多生物燃料有效生產(chǎn)中是至關(guān)重要的,并且在非水相催化工業(yè)生物技術(shù)中也占據(jù)關(guān)鍵地位,因此,獲得一株溶劑耐受能力較好的宿主菌具有很大的研究價值和工業(yè)應(yīng)用潛力。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)是常被用于環(huán)境生物修復(fù)、生物活性物質(zhì)合成等領(lǐng)域的重要工業(yè)微生物。大腸桿菌(Escherichia coli)是一類遺傳背景清晰的平臺微生物,其較差的有機溶劑耐受性成為工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。本文基于sRNA調(diào)節(jié)基因及其分子伴侶工程、ARTP隨機誘變技術(shù)兩個研究方向來獲得高正丁醇耐受性的大腸桿菌。一方面,通過在E.coli JM109中過表達(dá)sRNA調(diào)節(jié)基因(hfq,fur,sgrs和rpoS)或RNA伴侶基因(hfq,fur,rpoH,stpA,nusB,cspC,cspD,proQ和ffh)來改善對正丁醇的耐受性。在添加8 g·L~(-1)正丁醇的條件下,JM109/pQE80L-rpoS過表達(dá)菌株的耐受性相比于對照菌株提高了41%。然后,將rpoS基因與兩個分子伴侶基因(secB和groS)共表達(dá)。在9.6 g·L~(-1)正丁醇濃度下,菌株JM109/pQE80L-groS-secB-rpoS的正丁醇耐受性是對照菌株的近3倍,并且通過實驗發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)順序差異會影響菌株的正丁醇耐受性。此外,通過構(gòu)建rpoS基因隨機突變文庫,篩選了10000個左右的突變體,最終獲得正丁醇耐受性提高1.5倍的突變體C11和1.8倍的突變體D5。另一方面,基于ARTP隨機誘變技術(shù)對P.putida 901進(jìn)行誘變,再經(jīng)過一系列正丁醇濃度下的傳代馴化,獲得在8 g·L~(-1)的正丁醇添加下耐受性提高了約2倍的突變體,并且其對正丁醇的最大耐受濃度進(jìn)一步提高到12 g·L~(-1)。通過Illumina HiSeq平臺對突變株與對照菌株進(jìn)行全基因組重測序,結(jié)果顯示共獲得大約1900萬對reads,平均讀長為150nt,與參考基因組的片段配對率為92.03%,覆蓋率為90.34%。共檢測到40704個單核苷酸位點變異(Single Nucleotide Variation,SNV),其中純合的為39319個,雜合的為1385個;存在2153個基因小片段插入/缺失序列(InsertDeletions,InDels),其中純合的突變位點數(shù)量為1871個,雜合的突變位點數(shù)量為282個。最后,將所有突變進(jìn)行GO/KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋,發(fā)現(xiàn)突變數(shù)目最多的是涉及到代謝相關(guān)基因,其中以氨基酸代謝和糖代謝路徑相關(guān)基因為主。綜上,本研究基于sRNA調(diào)節(jié)基因及分子伴侶工程等基因工程策略,提高了大腸桿菌的正丁醇耐受性,并通過ARTP隨機誘變技術(shù)與生物信息學(xué)分析為篩選大腸桿菌正丁醇耐受性的元件及大腸桿菌宿主菌的表型改造提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 2-1ARTP 隨機誘變過程Fig. 2-1 Process ofARTP random mutagenesis（2）誘變菌的傳代馴化：經(jīng) ARTP 誘變后的后培養(yǎng)菌液在均勻涂板后待長出單菌落，用液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將菌落從固體平板上洗脫至搖瓶（50 mL）中，150 r·min-1振蕩培養(yǎng) 6 h，再加入適量濃度的正丁醇，繼續(xù)培養(yǎng) 18h 后以 1.5%（v/v）的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接傳代。每個正丁醇濃度傳代轉(zhuǎn)接 5-10 輪，起始正丁醇濃度為 4g·L-1，最后通過根據(jù)式 2.3 計算它們的比生長速率，對最終的馴化菌株進(jìn)行正丁醇耐受性的比較。2.2.11 誘變馴化菌的基因組重測序及數(shù)據(jù)分析本研究中利用 Illumina HiSeq 測序平臺進(jìn)行全基因組重測序，根據(jù)制造商所給方案進(jìn)行二代測序樣品庫的構(gòu)建。首先對基因組 DNA 序列隨機切斷，得到小于 500bp 的片段，用 End Prep Enzyme Mix 處理片段進(jìn)行末端修復(fù)，使其在一個反應(yīng)中同時進(jìn)行 5'磷酸化和 dA 加尾，最后通過 T-A 連接來在兩端添加銜接子。使用 AxyPrepMagPCRClean-up（Axygen）對銜接子修飾后的 DNA 片段進(jìn)行分離純化，從中回收長度約 410bp 的片

圖 3-2 異源 secB 基因過表達(dá)時對大腸桿菌正丁醇耐受性的影響Fig. 3-2 n-Butanol tolerance of E. coli in overexpression of heterologous secB genes接著通過實驗驗證 2.2.3 中單基因過表達(dá)時的正丁醇耐受性，，由于 SDS-PAGE 分析發(fā)現(xiàn)在 ffh（62kDa），rpoH（39kDa），stpA（18kDa）和 sgrs（9kDa）基因過表達(dá)菌株中未發(fā)現(xiàn)明顯表達(dá)條帶，因此并未對其耐受性進(jìn)行深入研究（圖 3-3）。其它基因過表達(dá)菌株的正丁醇耐受性結(jié)果如圖 3-4 所示，在添加 8 g·L-1正丁醇時，發(fā)現(xiàn)基因 groS，rpoS，asr，acrR，cspD，groL，clpB，nusB，grpE 和 proQ 的過表達(dá)能夠提高重組菌株的正丁醇耐受性。相比于對照菌株 JM109/pQE80L，其中 AcrR，NusB，ClpB，ProQ 的過表達(dá)能夠?qū)⒛褪苄蕴岣呓?2 倍（圖 3-4A，3-4B，3-4C），而 GroL 和 GroS 的過表達(dá)僅僅提高了約 25%（圖 3-4D，3-4E），其中正丁醇耐受性提高最顯著的是 RpoS 的過表達(dá)菌株，耐受性提高了近 4 倍（圖 3-4E），其中 Asr，GrpE，CspD 的過表達(dá)菌株的正丁醇耐受性提高不顯著，而 Fur，Hfq，SugE，CspC 的過表達(dá)菌株的正丁醇耐受性并無提升。綜上，相比于菌株 JM109/pQE80L-Ec-secB，其中只有 RpoS 的過表達(dá)能夠與其媲美。0 2 4 6 8 10 12時間/ h
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q939.9

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本文編號：2662052