【摘要】：胞內(nèi)勞森氏菌(Lawsonia intracellularis)是一種新的專性胞內(nèi)寄生革蘭氏陰性細(xì)菌,被鑒定為多種動物(主要是豬)的傳染性疾病增殖性腸病(PE)的病原。胞內(nèi)勞森菌基因組序列表明其具有III型分泌系統(tǒng)(T3SS),在細(xì)菌入侵和逃避宿主固有免疫系統(tǒng)的過程中起輔助作用,是誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。T3SS(T3ES)通常以保守的真核細(xì)胞過程為目標(biāo),而T3ES在胞內(nèi)分泌的效應(yīng)因子尚未見報道。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一個已建立的成熟的模型系統(tǒng)用于揭示其功能,通常在實(shí)驗(yàn)室中分析病原體特異性基因產(chǎn)物的功能。通過釀酒酵母菌株表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)所有假想基因的生長抑制篩選,首次發(fā)現(xiàn)LI1035具有抑制酵母生長的作用。14株絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)酵母單倍體缺失株中,有2株恢復(fù)LI1035對細(xì)胞生長的抑制作用,提示LI1035與酵母中MAPK通路的組分相互作用。磷酸化分析證實(shí)LI1035在酵母和哺乳動物細(xì)胞中抑制MAPK信號通路。肌動蛋白染色分析表明,LI1035調(diào)節(jié)酵母和哺乳動物細(xì)胞的肌動蛋白組織。胞內(nèi)勞森菌LI1035作為假定的效應(yīng)蛋白會改變MAPK途徑,調(diào)節(jié)宿主的肌動蛋白組織。為了確定外源蛋白在釀酒酵母細(xì)胞中的共定位提供參考,構(gòu)建釀酒酵母熒光定位報告菌株。運(yùn)用染色體同源重組的方法,將突變的、已進(jìn)行酵母表達(dá)優(yōu)化紅色熒光蛋白RedStar整合到12個酵母細(xì)胞器標(biāo)記蛋白的C端,與之進(jìn)行融合表達(dá),用特異性引物對每一個酵母熒光定位報告菌株進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光檢測和形態(tài)特征觀察,對線粒體和細(xì)胞核進(jìn)行了特異性染料染色,用GFP標(biāo)記沙門氏菌已知定位蛋白SipA,與構(gòu)建的相應(yīng)熒光定位報告菌株進(jìn)行共定位。構(gòu)建的釀酒酵母熒光定位報告菌株可分別標(biāo)示酵母細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、脂滴、初級內(nèi)吞體、次級內(nèi)吞體、順式高爾基體、反式高爾基體及線粒體。菌落PCR、熒光檢測、染料與相應(yīng)報告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA與相應(yīng)報告菌株的共定位均提示報告菌株構(gòu)建成功。這些報告菌株的構(gòu)建,為日后在酵母中觀察細(xì)胞器動態(tài)變化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基礎(chǔ)性工具。
【圖文】：

圖 1-1 胞內(nèi)勞森菌電鏡圖wsonia intracellularis of electron mic（需要消耗宿主線粒體三磷酸鹽培養(yǎng)[30]。該菌分離培養(yǎng)的條件內(nèi)勞森氏菌。國外也僅有少數(shù)菌的體外培養(yǎng)最初是在單層小環(huán)境，37℃培養(yǎng)），，目前常在 37共培養(yǎng)[31]。具有單極鞭毛，從感染的腸細(xì) GC 值、小基因組以及熱休克生體中。該菌大量定植在未成有關(guān)[33]。侵入上皮細(xì)胞的細(xì)菌非吸收溶質(zhì)會導(dǎo)致滲出性或吸吸收能力下降，對飼料利用率基因的激活時，被感染的腸上

森菌 LI1035 靶向酵母和哺乳動物的 MAPK 通路并調(diào)節(jié)其肌動蛋白組體內(nèi)感染過程的致病機(jī)理的認(rèn)識，因此目前對該菌的致病機(jī)界上成功分離得到 17 株胞內(nèi)勞森菌，NCBI 上傳有 PHE/MN登錄號 PRJNA183）和 N343（2013 年 1 月上傳，登錄號 PRJN內(nèi)勞森菌分離株的全基因組序列，分別注釋 1419 和 1421 種被注釋為具有未知功能的假設(shè) ORF，且兩分離株在基因組]。該基因組序列包括一個小的單基因組 1.46 Mb 環(huán)形染色體及個質(zhì)粒，總長約 1.72×106bp，預(yù)計編碼 1340 個基因（27.3]，共 366 個為功能未知蛋白。基因組序列分析表明該菌存在Ⅲ型分泌系統(tǒng)[42-43]。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78

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本文編號：2656289