【摘要】：著床前胚胎的發(fā)育和由早期囊胚衍生而來(lái)的干細(xì)胞系受到高度調(diào)節(jié)。從小鼠的囊胚期,可以分離出三種不同的干細(xì)胞類型并且可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)。這些干細(xì)胞類型包括來(lái)自滋養(yǎng)外胚層的滋養(yǎng)層干細(xì)胞(Trophoblast Stem,TS);來(lái)自原始內(nèi)胚層的干細(xì)胞樣胚外內(nèi)胚層(Stem-cell-like Extraembryonic Endoderm,XEN)細(xì)胞以及分離自著床前的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(Inner cell mass,ICM),即胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESCs);其中研究最熱的是小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)。在體外合適的培養(yǎng)條件下,ESCs只保持無(wú)限增值的能力而不發(fā)生分化,簡(jiǎn)稱“自我更新”,同時(shí)保留分化成三個(gè)胚層的能力,簡(jiǎn)稱“多能性”。到目前為止,雖然已經(jīng)建立了多個(gè)物種的類似胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞系,但是只有來(lái)源于小鼠和大鼠的胚胎干細(xì)胞可以產(chǎn)生嵌合體后代,稱為naive多能性狀態(tài)。有趣的是,在自我更新的特性和形態(tài)方面,人胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)更類似于小鼠外胚層干細(xì)胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)而不是mESCs,我們稱這個(gè)狀態(tài)為primed多能性狀態(tài)。值得注意的是,通過(guò)過(guò)表達(dá)單個(gè)基因,例如Stat3,Tfcp211和Klf4,可以將primed多能性狀態(tài)的ESCs重編程回到naive多能性狀態(tài)。mESCs和mEpiSCs需要不同的培養(yǎng)條件來(lái)維持多能性。mEpiSCs主要依賴成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)和重組人激活素-A(Recombinant Human Activin-A,ActivinA)來(lái)維持自我更新。而mESCs可以通過(guò)兩種不同的培養(yǎng)體系來(lái)維持自我更新:添加白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor,LIF)的血清培養(yǎng)基,以及添加兩個(gè)小分子抑制劑(2i)的無(wú)血清培養(yǎng)基N2B27,2i指CHIR99021和PD0325901,它們維持自我更新分別是通過(guò)抑制糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)和分裂原活化蛋白激酶的激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MEK),而LIF維持自我更新是通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活因子3(STAT3),從而進(jìn)一步激活STAT3下游的一些多能性基因,比如:Tfcp211,Kl4,和Piml等,其中的每一個(gè)過(guò)表達(dá)都可以替代STAT3來(lái)維持自我更新。但是,只有下調(diào)Tfcp211的表達(dá)才能夠削弱LIF/STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)的自我更新和mEpiSCs的重編程。先前的文獻(xiàn)報(bào)道,作為L(zhǎng)IF/STAT3下游的靶基因,轉(zhuǎn)錄因子Tfcp211(Transcription factor CP2-like protein 1),在建立和維持mESC naive多能性狀態(tài)中扮演著很重要的角色。Tfcp211的過(guò)表達(dá)不僅可以取代LIF和2i中的任何一個(gè)因子的作用來(lái)促進(jìn)mESCs的自我更新能力,還可以提高mEpiSCs重編程為naive多能性狀態(tài)的效率。但是,Tfcp211是通過(guò)下游的哪些靶基因的作用來(lái)維持自我更新還不清楚。為了研究這個(gè)問(wèn)題,我們首先鑒定出Tfcp211下游的靶基因,再對(duì)其進(jìn)行一系列的驗(yàn)證。根據(jù)2014年Dunn S J在Science雜志上發(fā)表的一篇文獻(xiàn)[Doi:10.1126/science.1248882],Estrogen related receptor beta(Esrrb)和Salian-like gene(Sa114)可能是Tfcp211下游的靶基因。為了驗(yàn)證這一預(yù)測(cè),我們首先在小鼠胚胎干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Tfcp211,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析Esrrb和Sa114的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Tfcp211只有Esrrb的表達(dá)量較高,我們初步確定了Esrrb是Tfcp211的下游靶基因。接著,為了進(jìn)一步確定Esrrb是Tfcp211的下游靶基因,我們實(shí)施了以下4個(gè)實(shí)驗(yàn)。第一,我們構(gòu)建了一個(gè)Tfcp211可誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞株,并分時(shí)間段加入四環(huán)素(DOX)來(lái)誘導(dǎo)Tfcp211的表達(dá),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析Esrrb的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng),Esrrb的表達(dá)量越高。第二,在mESCs中下調(diào)Tfcp211的表達(dá),qRT-PCR結(jié)果顯示,Esrrb的表達(dá)量也隨之降低。第三,我們從JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了Tfcp211在Esrrb啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn),并進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)。結(jié)果顯示,Tfcp211在Esrrb啟動(dòng)子上具有很高的結(jié)合能力。最后,為了進(jìn)一步驗(yàn)證Tfcp211與Esrrb的相互作用,我們?cè)贓srrb啟動(dòng)子上突變了Tfcp211結(jié)合位點(diǎn),并做了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,野生型的熒光強(qiáng)度是突變型的熒光強(qiáng)度的2.7倍。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明,Esrrb是Tfcp211下游的直接靶基因。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明,Esrrb是Tfcp211的直接靶基因,那么Esrrb是否可以調(diào)控Tfcp211的功能呢?因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。第一,在過(guò)表達(dá)Tfcp211的mESCs中下調(diào)Esrrb,經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、堿性磷酸酶染色以及免疫熒光實(shí)驗(yàn),表明干擾Esrrb的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致過(guò)表達(dá)Tfcp211的小鼠胚胎干細(xì)胞分化;第二,在mEpiSCs中過(guò)表達(dá)Tfcp211,同時(shí)下調(diào)Esrrb的表達(dá),結(jié)果顯示Esrrb能夠削弱Tfcp211重編程mEpiSCs回到mESCs的能力。綜上所述,我們的研究結(jié)果證明Tfcp211主要通過(guò)誘導(dǎo)Esrrb的表達(dá)來(lái)維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新。該研究結(jié)果不僅豐富和完善了干細(xì)胞多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò),而且為干細(xì)胞以后的臨床應(yīng)用打下了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

１．１初篩Ｔｆｃｐ２１１下游靶基因逡逑根據(jù)２０１４年Ｄｕｎｎ邋Ｓ邋Ｊ在Ｓｃｉｅｎｃｅ雜志上發(fā)表的一篇文獻(xiàn)［Ｄｏｉ．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ｌ２４８８８２］，作者根據(jù)生物信息學(xué)分析顯示，和＆／／４可能ｃｐ２１１下游的靶基因，所以我們先進(jìn)行初篩。逡逑第一，我們構(gòu)建了一個(gè)帶有ＦＬＡＧ標(biāo)簽的過(guò)表達(dá)Ｔｆｃｐ２１１邋（ＰＢ－ｍＴｆｃｐ２１１）Ｃ細(xì)胞，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)證明ＴＦＣＰ２Ｌ１蛋白在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)成功（ＦｉＡ）。逡逑第二，對(duì)ＰＢ－ｍＴｆｃｐ２１１的４６Ｃ細(xì)胞進(jìn)行提取總ＲＮＡ，再通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ檢和基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Ｔｆｃｐ２１１只有表達(dá)量較Ｆｉｇ．邋１Ｂ）。逡逑根據(jù)這個(gè)結(jié)果，我們可以初步確定是Ｔｆｃｐ２１１下游的靶基因。逡逑

逡逑３．１．２邋Ｔｆｃｐ２１１調(diào)控下游Ｅｓｒｒｂ的表達(dá)逡逑經(jīng)過(guò)初篩之后，我們排除了邋ＳａｌＩ４基因。接下來(lái)為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ｅｓｒｒｂ是是Ｔｆｃｐ２１１可能的靶基因，我們從以下兩個(gè)方面進(jìn)行探宄。逡逑第一，我們構(gòu)建了邋ＴｆＣｐ２ｌｌ可誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞株，并分時(shí)間段加入四環(huán)（邋ＤＯＸ）來(lái)誘導(dǎo)腳２＂的表達(dá)，通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ分析Ｅｓｒｒｂ的表達(dá)情況。結(jié)果示，的表達(dá)量隨著四環(huán)素誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升（Ｆｉｇ．邋２Ａ）。逡逑第二，我們?yōu)榱舜_定７７ｃｐ２／／的下調(diào)，Ｅｓｒｒｂ表達(dá)如何，，我們構(gòu)建了邋Ｔｆｃｐ２慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞0１１７７＃２＂媯＃７邋ｆ／７．ｖＭ２），并通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ｒ＃表達(dá)量下降了邋７０－８０％，而的表達(dá)量也隨著下降了（Ｆｉｇ．邋２Ｂ）。逡逑以上說(shuō)明在轉(zhuǎn)錄水平上，；刀／可以調(diào)控的表達(dá)。逡逑
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q132

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本文編號(hào)：2656393