【摘要】：氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的最主要的大量元素之一,氮肥的施用是維持作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵。農(nóng)業(yè)上施加大量的氮肥以提高作物的產(chǎn)量,但由于作物對(duì)氮肥的吸收利用率低,使得未被植物吸收利用的氮素流失到環(huán)境中,造成了嚴(yán)重的面源污染。因此,必須加強(qiáng)對(duì)植物吸收利用氮素的分子規(guī)律和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究,以提高作物的氮素利用率、推動(dòng)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但由于植物體內(nèi)調(diào)控氮素吸收利用的機(jī)制十分精細(xì)復(fù)雜,使得對(duì)氮素調(diào)控的研究進(jìn)展十分緩慢。本研究利用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)到強(qiáng)烈響應(yīng)NO_3~-的lncRNA T5120,同時(shí)還利用正向遺傳學(xué)的方法克隆出1個(gè)NO_3~-負(fù)調(diào)控基因NSIG,并對(duì)它們?cè)贜O_3~-信號(hào)及代謝調(diào)控方面的功能進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的分析。一、LncRNA T5120調(diào)控NO_3~-信號(hào)及同化利用長(zhǎng)鏈非編碼RNA在各個(gè)生物學(xué)進(jìn)程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用,但目前還未有其在硝態(tài)氮調(diào)控方面的報(bào)道。我們利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)受NO_3~-處理影響的lncRNAs,結(jié)合qPCR技術(shù)的驗(yàn)證結(jié)果,鑒定出六個(gè)受NO_3~-強(qiáng)烈誘導(dǎo)的lncRNAs,其中T5120的NO_3~-誘導(dǎo)量最高;進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)T5120的表達(dá)在硝態(tài)氮還原酶(NR-null)突變體中仍受NO_3~-的誘導(dǎo),說(shuō)明T5120的表達(dá)可以直接受NO_3~-信號(hào)的誘導(dǎo),而不是NO_3~-的還原產(chǎn)物。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T5120過(guò)表達(dá)系中NO_3~-響應(yīng)基因的NO_3~-誘導(dǎo)量明顯升高,表明T5120能調(diào)控植物對(duì)NO_3~-的響應(yīng);生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T5120過(guò)表達(dá)系的NO_3~-含量顯著降低;進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)系的硝態(tài)氮還原酶(NR)活性和氨基酸含量明顯升高,而對(duì)NO_3~-的吸收不變,說(shuō)明過(guò)表達(dá)系中NO_3~-含量降低是由于同化作用增強(qiáng)造成的。分子水平的檢測(cè)結(jié)果表明,T5120過(guò)表達(dá)系中部分NO_3~-同化基因的表達(dá)量顯著增加。上述結(jié)果說(shuō)明T5120能促進(jìn)植物對(duì)NO_3~-的初級(jí)響應(yīng)和同化利用。為進(jìn)一步了解T5120的作用機(jī)制,我們分析了T5120的啟動(dòng)子序列,發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)NO_3~-響應(yīng)(NRE-like)元件;隨后利用Y1H和ChIP-qPCR技術(shù)進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示NLP7可以結(jié)合T5120的啟動(dòng)子,LUC/REN雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析表明NLP7可以激活T5120的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)NLP7可以調(diào)控T5120的表達(dá)和NO_3~-誘導(dǎo)量,這些結(jié)果說(shuō)明NLP7可以直接結(jié)合T5120并調(diào)控其表達(dá)。將T5120在nlp7-4突變體中過(guò)表達(dá),發(fā)現(xiàn)T5120/nlp7-4株系根部的熒光明顯強(qiáng)于nlp7-4突變體;T5120/nlp7-4株系的NR活性和NO_3~-同化基因的表達(dá)明顯升高,表明T5120能部分恢復(fù)nlp7突變體在NO_3~-信號(hào)及同化方面的缺陷。上述結(jié)果說(shuō)明T5120作用于NLP7的下游調(diào)控NO_3~-信號(hào)。通過(guò)對(duì)T5120過(guò)表達(dá)系在低和高兩種NO_3~-濃度條件下的表型觀察及統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)T5120能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。二、NSIG調(diào)控NO_3~-信號(hào)及代謝正向遺傳學(xué)是克隆新基因的有效途徑,本研究還利用NO_3~-調(diào)控基因篩選系統(tǒng)克隆出一個(gè)新基因NSIG。在無(wú)NO_3~-的培養(yǎng)條件下,含NO_3~-響應(yīng)啟動(dòng)子(NRP-YFP)的野生型幼苗根部不發(fā)熒光,通過(guò)篩選突變?nèi)后w,篩選出一個(gè)根部發(fā)強(qiáng)熒光的NO_3~-負(fù)調(diào)控突變體E7;通過(guò)圖位克隆和全基因組測(cè)序確定突變基因?yàn)橐粋�(gè)新的NO_3~-調(diào)控基因,將其命名為NSIG(NITRATE SIGNALING INHIBITED GENE),原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明該蛋白定位于細(xì)胞核中。RNA-seq分析顯示E7突變體中多個(gè)NO_3~-響應(yīng)基因的表達(dá)顯著高于野生型,說(shuō)明NSIG負(fù)調(diào)控NO_3~-信號(hào);進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),有NO_3~-存在下,NSIG依然負(fù)調(diào)控NO_3~-信號(hào),說(shuō)明NSIG對(duì)NO_3~-信號(hào)的負(fù)調(diào)控作用不依賴于NO_3~-。為研究NSIG在NO_3~-代謝方面的功能,我們檢測(cè)了E7突變體中的NO_3~-含量,發(fā)現(xiàn)突變體中NO_3~-含量降低;深入的研究發(fā)現(xiàn)E7突變體對(duì)NO_3~-的吸收降低,而NR活性和氨基酸含量升高,分子水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E7突變體中轉(zhuǎn)運(yùn)基因NRT1.1的表達(dá)下降,而部分NO_3~-同化基因的表達(dá)升高。這些結(jié)果說(shuō)明NSIG調(diào)控了植物對(duì)NO_3~-的吸收和同化。為研究NSIG與NRT1.1的作用關(guān)系,我們分別檢測(cè)了單基因突變體中另一基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)E7突變體中NRT1.1的表達(dá)顯著降低,而nrt1.1突變體中NSIG的表達(dá)沒(méi)有變化;接下來(lái)我們構(gòu)建了E7 chl1-13的雙突變體,并對(duì)其熒光進(jìn)行了觀察,發(fā)現(xiàn)NSIG與NRT1.1在不同通路上調(diào)控NO_3~-的信號(hào)。上述結(jié)果表明NSIG可以調(diào)控NRT1.1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能,但不影響其信號(hào)功能。通過(guò)對(duì)NSIG與NLP7作用關(guān)系的研究,發(fā)現(xiàn)NSIG與NLP7在NO_3~-信號(hào)調(diào)控途徑中也是相互獨(dú)立的。本研究克隆了兩個(gè)新的NO_3~-調(diào)控基因T5120和NSIG、鑒定了它們?cè)贜O_3~-調(diào)控方面的功能、闡明了它們的作用機(jī)制,為解析植物體內(nèi)的NO_3~-調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)、為提高作物的氮素利用率提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥 NRT1 和 NRT2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生理功能（Wang et al., 2018）-1 Physiological functions of NRT1 and NRT2 proteins in Arabidopsis (Wang et alC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族 蛋白是氯離子通道蛋白，目前，已在擬南芥中鑒定出 7 個(gè) CLC 家族定位于液泡膜上，是 NO3-和質(zhì)子反向運(yùn)輸?shù)牡鞍�。與野生型相比，積累量顯著減低，表明 CLCa 參與液泡中 NO3-積累的過(guò)程（Angeli et外，其它 CLC 家族成員的功能還未見(jiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn) CLCb、CLCc定位于液泡膜上，CLCe 定位于葉綠體中，而 CLCd 和 CLCf 定位于 Fecht-Bartenbach et al., 2010）。AC/SLAH 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族C/SLAH 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是慢性陰離子通道蛋白，主要在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞芥中已鑒定出 5 個(gè) SLAC/SLAH 家族成員，分別是 SLAC1 和 SLAH

需被同化為有機(jī)物后才可被植物吸收利用。NO3在硝酸還原酶（NR）的作用下被還原為 NO2-，該還原過(guò)程在細(xì)胞質(zhì)中完成。擬南芥中有 2 個(gè)編碼 NR 酶的基因，分別是 NIA1和 NIA2，它們的表達(dá)受 NO3-的誘導(dǎo)，且 NR 酶的活性受光照、供氧量、PH 等環(huán)境因素的影響（Cookson et al., 2005; Jonassen et al., 2009）。NO2-的積累對(duì)植物有毒害作用，，需在亞硝酸還原酶（NIR）的作用下還原為 NH4+，該過(guò)程既可以在根的質(zhì)體，也可以在葉的葉綠體中完成。圖 1-2 為 NO3-在葉和根中被還原為 NH4+的過(guò)程（孟慶偉等，2017）。質(zhì)體或葉綠體中的NH4+在谷氨酰胺合成酶的作用下合成谷氨酰胺，植物中有GS1和GS2兩種谷氨酰胺合成酶。其中 GS1 有多個(gè)同源基因編碼，分別是 GLN1.1、GLN1.2、GLN1.3、GLN1.4，且主要在無(wú)法進(jìn)行光合作用的細(xì)胞中發(fā)揮功能；而 GS2 是由單基因編碼的，主要在葉綠體中發(fā)揮功能，還可將光呼吸過(guò)程產(chǎn)生的 NH4+轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺（Wallsgroveet al., 1987; Cren & Hirel, 1999; Tabuchi et al., 2005）。谷氨酰胺可在谷氨酸合酶的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酸，而谷氨酸可作為前體用于合成其它氨基酸和酰胺被植物利用（吳巍和趙軍，2010）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2

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1 劉飛;擬南芥硝態(tài)氮調(diào)控基因T5120和NSIG的克隆與功能鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2649048