發(fā)布時間：2020-05-02 15:56

【摘要】：鄰苯二甲酸酯(Phthalate esters,PAEs),俗稱增塑劑,被廣泛地應(yīng)用于各類塑料制品的生產(chǎn)和加工。其中的鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)在全球范圍內(nèi)的使用量最大,近年的年消費(fèi)量超過300萬噸。研究表明,PAEs作為環(huán)境激素(Environmental Endocrine Disruptors,EEDs)會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成極大的危害,在低濃度下即可干擾人和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。在過去的幾十年中,生物降解法作為PAEs主要的降解方式被國內(nèi)外學(xué)者廣泛地報道。目前,已知的PAEs水解酶主要作用于短烷基側(cè)鏈PAEs和鄰苯二甲酸單酯中酯鍵的水解,然而,最受關(guān)注的DEHP降解酶的報道卻很少。至今為止,DEHP降解酶的基因和蛋白質(zhì)序列,以及酶學(xué)特征仍是未知的,這阻礙了我們對大側(cè)鏈PAEs酶學(xué)降解的認(rèn)識和進(jìn)一步的應(yīng)用。本研究首先采用菌種馴化的方法從200份被塑料垃圾污染的土壤樣品中分離鑒定出6株對DEHP具有催化活性的菌株,包括1株Rhodococcus sp.,1株Micrococcus sp.和4株Gorrdonia sp.,其中,Gordonia polyisoprenivorans 5F催化活性最高。通過對降解中間產(chǎn)物的分析,我們推測出DEHP在菌株5F中的降解路徑。接著通過基因挖掘技術(shù)從5F菌株中克隆得到17個潛在的酯酶基因,將它們連接到pET-28a質(zhì)粒載體上,導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)。最終成功篩選到可降解DEHP的目標(biāo)酶(GoEst15),該酶可將DEHP降解成鄰苯二甲酸單(2-乙基已)酯(MEHP)。通過對GoEst15的純化,確定了該酶蛋白的分子量為58 kDa,利用酯酶的模式底物對硝基苯酚丁酸酯(pNPB)測出其反應(yīng)的最適pH和溫度分別為7.0和30。對于DEHP,GoEst15的Km和kcat/Km值分別為0.31 mM和0.16 s-1mM-1。降解反應(yīng)研究顯示,在1 mL反應(yīng)體系中,0.15 mg GoEstl5可在24小時內(nèi)完全降解5mM的DEHP;而完全降解5 mM的DBP,僅需要1小時。底物譜測試實(shí)驗(yàn)表明,該酶能夠催化十一種PAEs的降解反應(yīng),是一種罕見的廣譜酯酶。此外,我們還挖掘到了Gordoniapoly soprenivorans 5F中的MEHP水解酶(GoEstM1),并構(gòu)建了GoEst15和GoEstM1的共表達(dá)體系,利用該體系可實(shí)現(xiàn)從PAEs到鄰苯二甲酸(PA)的一步轉(zhuǎn)化。綜上所述,GoEst15是新發(fā)現(xiàn)的一種能夠降解DEHP的酯酶。由于其良好的降解效果和廣泛的底物譜,該酶將是一種很有前景的生物催化劑,可作為蛋白質(zhì)工程的起始酶,為未來污染物生物降解,土體生物修復(fù)和水治理開發(fā)綠色、溫和、高效的技術(shù)。
【圖文】：

２．３．３菌株復(fù)篩結(jié)果逡逑將得到的六種單菌株與１邋ｇ／Ｌ邋ＤＥＨＰ反應(yīng)４天后進(jìn)行ＴＬＣ分析，發(fā)現(xiàn)它們對ＤＥＨＰ逡逑均具有催化活性。薄層色譜分析結(jié)果如圖２．１所示，對照樣品Ｃ中的底物斑點(diǎn)最深，其逡逑余６個樣品的底物斑點(diǎn)均出現(xiàn)了不同程度的減少。其屮菌株５Ｆ與ＤＥＨＰ反應(yīng)液的底物逡逑斑點(diǎn)最淺，菌株ＳＪ２２和闡株ＳＪ６丨對應(yīng)的底物斑點(diǎn)也較淺，而其余三種菌株的反應(yīng)液中逡逑有較多的底物殘留。菌株６Ｆ－１與ＤＥＨＰ的反應(yīng)液中除了殘留的底物斑點(diǎn)外，還出現(xiàn)，逡逑米被降解的產(chǎn)物斑點(diǎn)，將反應(yīng)液進(jìn)行ＧＣ－ＭＳ分析，，鑒定出該產(chǎn)物為ＭＥＨＰ（ＧＣ－ＭＳ分逡逑析方法見第三章），由此可推測，菌株６Ｆ－１缺乏ＭＥＨＰ的代謝途徑或者存在的ＭＥＨＰ降逡逑解酶活力很低，導(dǎo)致ＤＥＨＰ無法完全降解。逡逑ｒ邐＾邋１逡逑＾－ＤＥＩＩＰ逡逑＾邐＞邋Ｌ邋Ｊ邋…邐＊邐一逡逑Ｃ邋ＳＪ６１邋ＳＪ２２邋５Ｆ邋６Ｆ－１邋Ｃ邋６ＦＴ邋ＦＸ１４逡逑圖２．１單菌株對ＤＥＨＰ活性大小的ＴＬＣ分析逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ａｓｓａｙ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｂｙ邋ＴＬＣ逡逑２．３．４菌種鑒定結(jié)果逡逑將得到的６個ＤＥＨＰ降解菌株進(jìn)行１６Ｓ邋ｒＲＮＡ鑒定，ＰＣＲ產(chǎn)物的核酸電泳圖如圖逡逑２．２所示，該圖顯示每個菌株的１６ＳｒＲＮＡ目的條帶清晰爭一，大小均在］５００邋ｂｐ左右。逡逑

３．３．１反應(yīng)最適ｐＨ逡逑５Ｆ在邋ｐＨ邋５．０邋到邋ｐＨ邋９．０邋的條件下者能句多降解利用邋ＤＥＨＰ。逡逑初始0Ｄ６0Ｇ為０．１的５Ｆ菌液與１邋ｇ／ＬＤＥＨＰ在３０°Ｃ反應(yīng)３天后的ＤＥＨＰ降解率如圖３．１逡逑所示，在ｐＨ邋７．０時有接近９０％的底物被降解掉，ｐＨ邋７．０、ｐＨ邋８．０和ｐＨ邋９．０的條件下對逡逑ＤＥＨＰ的降解效果明顯優(yōu)于ｐＨ邋５．０和ｐＨ邋６．０的情況�？梢娭行约捌珘A性的條件比酸性逡逑條件更利于菌株５Ｆ降解ＤＥＨＰ，從圖中可知反應(yīng)的最適ｐＨ為７．０，因此選擇此條件進(jìn)逡逑行后續(xù)的研[�。辶x希掊澹保玻板澹蟈義希

本文編號：2647235